Taq SYBR?Green qPCR Premix (None/Low/High ROX Universal)
REF: MP008/MP009/MP010/MP023
储运条件
长期保存请于 -20℃避光保存,Mix 融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月,尽量避免反复冻融。
产品组成
组分/规格
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MP008M
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MP009M
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MP010M
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MP023M
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(None ROX)
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5×1ml
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(Low ROX)
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5×1ml
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(High ROX)
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5×1ml
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Taq SYBR?Green qPCR Premix(Universal)
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5×1ml
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产品简介
Taq SYBR?Green qPCR Premix是SYBR?Green I嵌合染料法专用qPCR试剂,为2×预混液,包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶,配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子,是产品具有特异性强、扩增效率高等特点,有效抑制非特异性扩增,可对宽广浓度范围的模板进行准确定量,获得稳定可靠的qPCR结果。
使用方法
1. 适用机型
产品
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适用机型
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MP008(None ROX)
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Bio-Rad CFX 全系列;
Roche LightCycler? 系列;
Eppendorf Mastercycler? ep realplex 系列;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? 系列;
Takara Thermal Cycler Dice;
analytikjena qTOWER系列等
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MP009(Low ROX)
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ABI 7500/7500 Fast,ABI ViiA 7?;
ABI QuantStudio? 系列;
Stratagene Mx3000P?/3005P?/4000?
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MP010(High ROX)
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ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast,StepOne?,StepOne Plus?等
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MP023(Universal)
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全机型通用
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2.使用注意
① 因 Mix 中预混有染料,其保存或反应体系配制过程应避免强光照射;
② 使用前上下颠倒轻轻混匀 Mix,请勿涡旋振荡混匀,避免产生过多气泡。
3. 建议的qPCR反应体系
试剂
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使用量
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终浓度
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TaqSYBR? Green qPCRPremix
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10μl
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1×
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正向引物 (10 μM)a
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0.4 μl
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0.2 μM
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反向引物 (10 μM)a
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0.4 μl
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0.2 μM
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DNA 模板b
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X μl
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10~200ng/20 μl
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Nuclease-Free Water
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To 20 μl
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a.通常推荐的引物终浓度为0.2uM,反应效果不佳时可0.1~1μM范围内进行调整;
b.推荐模板加样量为1~2μl,如模板类型为未稀释cDNA原液,模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同,必要时可进行梯度稀释,以确定最佳的DNA模板添加量。
4. qPCR反应程序(可根据机型适当调整)
两步法
步骤
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温度
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时间
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预变形
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95 ℃
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30 sec
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变形
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95 ℃
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10 sec 40 个循环
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退火延伸a
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60℃
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30 sec
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熔解曲线b
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使用仪器默认采集程序
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三步法
步骤
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温度
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时间
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预变形
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95 ℃
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30 sec
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变形
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95 ℃
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10 sec
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退火a
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55~65 ℃
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10 sec 40 个循环
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延伸a
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72℃
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30 sec
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熔解曲线b
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使用仪器默认采集程序
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a.根据引物的Tm值进行退火(退火延伸)温度的设定;若扩增片段在 200 bp以内,延伸(退火延伸)时间可以设置为15 sec;此外,延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整;
b. 不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别,一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
5.实验优化
若使用默认反应条件反应性能不佳时,则需要进行反应条件的优化,可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行:
①引物浓度调整
当引物终浓度在0.1~1.0μM范围之间变化时,引物浓度越低,扩增特异性越高,但扩增效率会有所下降。
②扩增程序优化
需提高扩增特异性,可使用两步法程序或提高退火温度;需提高扩增效率,可使用三步法程序或延长延伸时间。
6.引物设计原则
① 扩增产物长度建议控制在 80~200 bp
② 引物长度为 18~25 bp;
③ 正向引物和反向引物的Tm 值相差不超过 1 ℃为佳,Tm 值控制在 58~62℃为佳;
④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之间;
⑤ 引物 A、G、C、T 整体分布尽量要均匀,避开 T/C 或者 A/G的连续结构(特别是 3'端);
⑥ 引物 3' 端最后一个碱基最好为 G 或者 C;
⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列;
⑧ 使用 NCBI BLAST 功能检索确认引物的特异性
常见问题
问题描述
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可能原因
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解决办法
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扩增曲线不光滑
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荧光信号太弱,经系统校正后产生
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确保 Mix 中预混的染料未降解;更换荧光信号收集更好的 qPCR 专用耗材
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扩增曲线断裂或下滑
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模板浓度较高,基线的终点值大于 Cq 值
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减小基线终点 (Cq 值 -4), 重新分析数据
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个别孔扩增曲线突然骤降
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反应管内留有气泡
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确保 Mix 完全溶解,请勿涡旋振荡混匀;加样完成后轻弹离心去除气泡;
延长预变性时间至10 min,以去除气泡
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反应结束无扩增曲线出现
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反应循环数偏少
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设置循环数为40,但更多的循环数会增加过多的背景信号
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荧光信号采集步骤未设置或者设置错误
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两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火 延伸阶段,三步法扩增程序应 当将信号采集设置在 72℃延伸阶段
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引物可能降解
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长期未用的引物,应先通过 PAGE 电泳检测完整性,以排除其降解的可能
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模板浓度过低
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减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
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模板降解
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重新制备模板,重复实验
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Cq 值出现过晚
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扩增效率低
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提高引物浓度,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物
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模板浓度过低
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减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
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模板降解
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重新制备模板,重复实验
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扩增产物过长
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扩增产物长度控制在 80~200 bp
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体系中存在 PCR 抑制剂
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一般为模板带入,加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验
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空白对照出现信号
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反应体系污染
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首先更换空白对照的水,如果还发生同样情况,继续更换引物、吸头、
PCR 管或启用新的 Mix;反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染
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出现引物二聚体等非特异性扩增
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一般在分析35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况,应配合熔解曲线分析;重新设计引物,调整引物浓度或优化 PCR 反应程序
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熔解曲线出现多峰
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引物设计不佳
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根据引物设计原则重新设计新引物
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引物浓度过高
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适当降低引物浓度
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实验重复性差
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加样误差大
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使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液;高倍稀释模板,加入大体积模板减少加样误差;放大qPCR反应体积
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模板浓度过低
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减少模板稀释倍数重复实验
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qPCR 仪不同位置的温度偏差
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定期校准 qPCR 仪
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