快速内切酶EcoRV
REF: MD043
5"...G A T A T C...3"
3"...C T A T A G...5"
同裂酶:Eco32I
注:同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。
建议反应条件
1× Reaction缓冲液;
37℃温育;
参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。
失活条件:80℃ 温育 20 min。
产品组成
组分 / 规格 |
MD043-200Rxns |
Storage |
快速内切酶EcoRV |
200 μl |
-20℃ |
10× ReactionBuffer |
1 ml |
-20℃ |
10× ReactionColor Buffer |
1 ml |
-20℃ |
产品说明
快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在 5~15 分钟内精确完成 DNA 切割的限制性内切酶,适用于质粒DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。快速内切酶 快速内切酶具有如下特点:5~15 分钟内即可完成酶切;共用一种酶切 Buffer,大大简化酶切反应体系;良好的酶活冗余度,轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外,伊势久去磷酸化、连接试剂在 Reaction酶切 Buffer 中具有 100% 活性,支持一管化反应,提升“酶切—修饰—连接”的体验。
使用方法
1. DNA 快速酶切流程
①冰上按照下表配制反应体系:
质粒DNA |
PCR 产物 |
基因组DNA |
|
ddH2O |
15μl |
16μl |
30μl |
10× ReactionBuffer 或 10× ReactionColor Buffer |
2μl |
3 μla |
5μl |
底物 DNA |
2 μl(up to 1 μg) |
10 μl(~0.2 μg) |
10 μl(5 μg) |
快速内切酶 EcoRV |
1μl |
1μl |
5μl |
Total |
20μl |
30μl |
50μl |
a. 本体系适用于经过纯化的PCR 产物酶切。未纯化的PCR 产物具备一定的离子强度,10× ReactionBuffer 加入量可适当减少至2μl。但由于DNA 聚合酶同时具有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行克隆等操作,建议酶切前对PCR 产物进行纯化。
② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋),然后瞬时离心以收集挂壁液滴;
③ 37℃温育 15 min(质粒),或 15~30 min(PCR 产物),或 30~60 min(基因组 DNA);
④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活,停止反应(可选)。
2. 双酶切或多酶切
① 每种快速内切酶的用量为 1 μl,并根据需要适当扩大反应体系;
② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10;
③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应温度下进行酶切反应。
3. 适用于质粒的扩大反应体系
DNA |
1 μg |
2 μg |
3 μg |
4 μg |
5 μg |
快速内切酶 EcoRV |
1μl |
2μl |
3μl |
4μl |
5μl |
10× ReactionBuffer 或 10× ReactionColor Buffer |
2μl |
2μl |
3μl |
4μl |
5μl |
Total |
20μl |
20μl |
30μl |
40μl |
50μl |
注:如果总反应体系大于 20 μl,应适当增加温育时间,尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
质量控制
质控项目 |
质控标准 |
功能活性检测 |
最适反应温度下,在 20 μl反应体系中,1 μl快速内切酶 EcoRV 能够在 15 min内完全消化 1 μgλDNA 。 |
星号活性测试 |
最适反应温度下,将1 μl快速内切酶 EcoRV 与1 μgλDNA 共同温育 3 h,未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解,延时酶切可能出现星号活性 |
酶切—连接—再酶切检测 |
最适反应温度下,使用 1 μl快速内切酶 EcoRV 消化底物,回收酶切产物。在 22 ℃下使用适量 Fast T4 DNA Ligase 可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后,使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。 |
非特异性内切酶活性检测 |
最适反应温度下,使用 1 μl快速内切酶EcoRV 与 1 μg超螺旋质粒 DNA 共同温育 4 h,使用琼脂糖凝胶电泳检测,质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。 |
蓝白斑检测 |
将含有单一lacZα 基因的载体以 1 μlEcoRV消化,重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞,涂布在含有对应抗生素、 IPTG 和 X-gal 的 LB 培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落,而连接错误(即 DNA 末端切口不完整)的产物将得到白色菌落。对于 Reaction系列限制酶而言,白色菌落比例应小于1%。 |
不同 DNA 中的酶切位点数量
λDNA |
ΦX174 |
pBR322 |
pUC57 |
pUC18/19 |
SV40 |
M13mp18/19 |
Adeno2 |
21 |
0 |
1 |
1 |
0 |
1 |
0 |
9 |
甲基化修饰影响
Dam |
Dcm |
CpG |
EcoKI |
EcoBI |
无影响 |
无影响 |
无影响 |
无影响 |
序列可能重叠 剪切可能受影响 |
在不同反应缓冲液中的活性
BIOISCO |
Thermo Scientific |
NEB |
Takara |
|
ReactionBuffer |
FastDigest Buffer |
CutSmart? Buffer |
QuickCut? Buffer |
|
活性 |
100% |
100% |
100% |
100% |
注:活性数据来自 BIOISCO 限制酶标准反应体系下的检测。