两步发酵法的第一步，先用根霉将糖类发酵生成富马酸，即富马酸发酵，这里的糖较多的使用葡萄糖，葡萄糖可由淀粉经双酶水解而得。

第二步是在前面所产的富马酸中接入酵母菌或细菌进行发酵，将富马酸转化为L-苹果酸，即转化发酵。采用这种方法，苹果酸对糖转化率最高可达60%以上，但是毕竟发酵周期太长，前后加起来要8～9天。虽然两步法与一步法一样，国内外学者正在不断地探索，取得了一些有价值的进展，但至今仍然未见工业化生产的报道。 无论是一步法还是两步法发酵，如以淀粉为原料，在使用前都需进行水解处理，使之成为葡萄糖，而淀粉的水解方法是双酶水解法。

3.将反丁烯二酸或顺丁烯二酸经高温高压催化加水，可制得DL-苹果酸。4.萃取法将未成熟的苹果、葡萄、桃等的果汁煮沸，加入石灰水，生成钙盐沉淀，然后再经处理生成游离苹果酸。此法目前已不采用。5.发酵法从反丁烯二酸利用生物酶发酵生产左旋苹果酸。6.DL-苹果酸的合成以顺丁烯二酸或反丁烯二酸在高温、加压下水合制取。用阴、阳离子交换树脂提纯。7.L-苹果酸的合成利用短杆菌氨基因细胞由反丁烯二酸制取。8.：FC，22，38，50，54；BU，39。9.制法：于高压反应釜中加入顺丁烯二酸（2）1.16kg（10mol），水2.1L，搅拌下升温至180～190℃，保持压力1Mpa，反应10h。冷却至100℃以下，放出残压。将反应液倒入蒸馏瓶中，减压浓缩，直至有结晶析出。冷却，抽滤，干燥，得苹果酸（1）1.2kg，mp128～130℃。收率90%。