Alkaline Phosphatase (Fast)

REF: MN005

储运条件

-20℃ 保存。

产品组成

产品简介

Alkaline Phosphatase (Fast)（简称：Fast AP）可催化DNA、RNA以及核苷酸5"端和 3"端磷酸基团的水解，也能够去除蛋白磷酸基团，但不能催化磷酸 二脂及磷酸三脂的水解。在37℃的条件下作用10分钟，该酶即可 使所有类型DNA的末端去磷酸化。由于该酶在FastCut酶切 Bu?er中具有100%活性，且失活条件为80℃温育20分钟，因此与 FastCut快速内切酶进行“酶切-去磷酸化”反应时，可在同管内 完成，大大简化了实验流程。

酶活单位定义

37℃条件下， Fast AP缓冲液环境中，10 min内能够将1 μg线 性化pUC57 DNA的5"末端去磷酸化所需要的酶量定义为1个活性 单位（U）。

质量控制

核酸内切酶残留测试

37℃条件下，将10 U Fast AP 加入到1 μg pUC19 DNA 中温育 4 h，未检测出由共价闭合环状 DNA 转变为带有缺刻的 DNA。

核酸外切酶残留测试

将酶液与双链DNA底物在37℃温育16 h，通过DNA电泳 检测双链DNA底物无变化。

蓝白斑测试

室温条件下，使用30 U的Fast T4 DNA Ligase连 接pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/PstI及pUC57 DNA/SmaI消 化产物1 h，然后用E.coli XL1-Blue感受态细胞转化连接产物，检测到少于1%的白斑。

使用方法

1. 质粒载体线性化与去磷酸化同步反应流程

① 于冰上配制如下反应体系：

试剂	使用量
质粒DNAa	1 μg
10× FastCut Bu?er	2μl
FastCut限制性内切酶	1μl
Fast AP	1U（1μl）
ddH2O	To 20 μl

a.为了保证去磷酸化的效率，质粒DNA应不含RNA和基因组DNA污染。

② 充分混匀并瞬离，37℃温育15~30 min。

注：如果延长温育时间，可能产生星号活性。

③ 80℃温育20 min，以终止反应。

2.核苷酸去磷酸化的实验流程

该方案适用于去除DNA的3"和5"端磷酸基团。

① 于冰上配制如下反应体系：

试剂	使用量
线性DNA	1 μg
10× AP Bu?er	2μl
Fast AP	1U（1μl）
ddH2O	To 20 μl

② 充分混匀并瞬离，37℃温育10 min。

③ 80℃温育20 min，以终止反应。

3. 蛋白质去磷酸基团的实验流程

① 于冰上配制如下反应体系：

试剂	使用量
10×FastCut Bu?er	2μl
磷酸化蛋白质	2~4 μg(终浓度0.1~0.2 mg/ml)
Fast AP	10U（10μl）
ddH2O	To 20 μl

② 充分混匀并瞬离，37℃温育1h。

③ 添加EDTA至50 mM的终浓度，或者添加钒酸钠（Na3VO4）至 10 mM的终浓度，以终止反应。

注：：以上为蛋白质去磷酸基团的反应体系和实验流程的举例，实验时请根据 具体底物类型调整Fast AP的使用量以及最佳温育时间。

注意事项

与Fast AP结合的DNA在琼脂糖凝胶中可能会出现条带偏移 或弥散，为避免此现象，可在样品中加入混有SDS的6× Loading Bu?er，先在80℃温育20 min，冰浴降温后再进行电泳。