REF: MC002

储运条件

-20℃ 保存。

产品组成

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25 nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术。

Fast DNA Assembly Mix 无缝克隆试剂盒最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于 95%。Mix 中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

实验步骤

1.实验流程概要

2.线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。

① 酶切制备

推荐使用BIOISCO快速内切酶进行双酶切， 使载体线性化完全，以降低转化背景 ( 假阳性克隆 )；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。

注 1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化； 注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。

②反向 PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

3.插入片段PCR引物设计

PCR 引物的 5" 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且 3" 端突出，则引物设计必须包含突出部分；若 5" 端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5"—上游载体末端同源序列 酶切位点（可选）基因特异性正向扩增序列— 3"

插入片段反向扩增引物：

3"—基因特异性反向扩增序列 酶切位点（可选）下游载体末端同源序列—5"

注 1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60% 时，重组效率最高；

注 2：本试剂盒所提供的 pUC 19 载体（Ampr）连接端序列如下：

EcoRI

5"-ATGACCATGATTACGCCA-3" 5"-AATTCACTGGCCGTCGTTTTAC-3"

3"-TACTGGTACTAATGCGGTTCGA-5" 3"-GTGACCGGCAGCAAAATG-5"

HindIII

4.插入片段的PCR扩增

推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的 20%。

5.重组反应

①于冰水浴中配置以下反应体系：

组分	反应体系	阴性对照	阳性对照（如有必要）
Fast DNA Assembly Mix	5μl	5μl	5μl
线性化载体a	50-200ng	50-200ng	pUC 19 Control Plasmid, Linearized, 1 μl
插入片段b	10-200ng	-	500 bp Control, Fragment, 1 μl
ddH2O	To10μl

注 3：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时，建议延长反应时间到30-60min；

注 4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于 -20℃。

注 1： -20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用。

6.重组产物转化

取 5~10 μl 反应液，加入到 100 μl 感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置 30 min。42℃ 热激 45~60 sec，冰浴 5 min。加 500μl SOC 或 LB 培养基，37℃ 振荡培养 40~60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于 37℃ 过夜培养。

注 1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率 10⁸ CFU/

μg 的感受态细胞；

注 2：菌落数取决于 PCR 产物与线性化载体的数量和纯度；

注 3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

7.阳性克隆检测

挑取单菌落至 10 μl ddH2O 中混匀，95℃裂解 10 min 后，取 1 μl 裂解液作为模板，进行菌落 PCR 鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

注 1：菌落 PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果； 注 2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。