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快速内切酶EcoRV

REF: MD043

5'...G A T A T C...3'

3'...C T A T A G...5'

同裂酶：Eco32I

注：同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。

建议反应条件

1× Reaction缓冲液；

37℃温育；

参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件：80℃ 温育 20 min。

产品组成

组分 / 规格	MD043-200Rxns	Storage
快速内切酶EcoRV	200 μl	-20℃
10× ReactionBuffer	1 ml	-20℃
10× ReactionColor Buffer	1 ml	-20℃

产品说明

快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在 5~15 分钟内精确完成 DNA 切割的限制性内切酶，适用于质粒DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。快速内切酶快速内切酶具有如下特点：5~15 分钟内即可完成酶切；共用一种酶切 Buffer，大大简化酶切反应体系；良好的酶活冗余度，轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外，伊势久去磷酸化、连接试剂在 Reaction酶切 Buffer 中具有 100% 活性，支持一管化反应，提升“酶切—修饰—连接”的体验。

使用方法

1. DNA 快速酶切流程

①冰上按照下表配制反应体系：


	质粒DNA	PCR 产物	基因组DNA
ddH2O	15μl	16μl	30μl
10× ReactionBuffer 或 10× ReactionColor Buffer	2μl	3 μl^a	5μl
底物 DNA	2 μl(up to 1 μg)	10 μl(~0.2 μg)	10 μl(5 μg)
快速内切酶 EcoRV	1μl	1μl	5μl
Total	20μl	30μl	50μl

a. 本体系适用于经过纯化的PCR 产物酶切。未纯化的PCR 产物具备一定的离子强度，10× ReactionBuffer 加入量可适当减少至2μl。但由于DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR 产物进行纯化。

② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；

③ 37℃温育 15 min（质粒），或 15~30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）；

④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应（可选）。

2. 双酶切或多酶切

① 每种快速内切酶的用量为 1 μl，并根据需要适当扩大反应体系；

② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10；

③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。

3. 适用于质粒的扩大反应体系

DNA	1 μg	2 μg	3 μg	4 μg	5 μg
快速内切酶 EcoRV	1μl	2μl	3μl	4μl	5μl
10× ReactionBuffer 或 10× ReactionColor Buffer	2μl	2μl	3μl	4μl	5μl
Total	20μl	20μl	30μl	40μl	50μl

注：如果总反应体系大于 20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

质量控制

质控项目	质控标准
功能活性检测	最适反应温度下，在 20 μl反应体系中，1 μl快速内切酶 EcoRV 能够在 15 min内完全消化 1 μgλDNA 。
星号活性测试	最适反应温度下，将1 μl快速内切酶 EcoRV 与1 μgλDNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，延时酶切可能出现星号活性
酶切—连接—再酶切检测	最适反应温度下，使用 1 μl快速内切酶 EcoRV 消化底物，回收酶切产物。在 22 ℃下使用适量 Fast T4 DNA Ligase 可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
非特异性内切酶活性检测	最适反应温度下，使用 1 μl快速内切酶EcoRV 与 1 μg超螺旋质粒 DNA 共同温育 4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。
蓝白斑检测	将含有单一lacZα 基因的载体以 1 μlEcoRV消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、 IPTG 和 X-gal 的 LB 培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即 DNA 末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于 Reaction系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。

不同 DNA 中的酶切位点数量

λDNA	ΦX174	pBR322	pUC57	pUC18/19	SV40	M13mp18/19	Adeno2
21	0	1	1	0	1	0	9

甲基化修饰影响

Dam

Dcm

CpG

EcoKI

EcoBI

无影响

序列可能重叠

剪切可能受影响

在不同反应缓冲液中的活性

	BIOISCO	Thermo Scientific	NEB	Takara
	ReactionBuffer	FastDigest Buffer	CutSmart? Buffer	QuickCut? Buffer
活性	100%	100%	100%	100%

注：活性数据来自 BIOISCO 限制酶标准反应体系下的检测。