线粒体转氢酶-1（TH-1）试剂盒说明书

分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

TH位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六，催化NADH NADP 和 NAD NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H 电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH，从而提高线粒体的抗氧化能力。

测定原理：

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP ）替代NADP ，TH-1催化 APADP 还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收，因此通过测定375nm光吸收增加速率，来计算TH-1活性。

试剂的组成和配制：

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-1（此步可选做）。

5、步骤4中的沉淀即为线粒体，加入500uL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于TH-1活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液，混匀，立即记录375nm处初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

TH-1活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样)÷T=164×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=82×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.164×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.1×10-3 L；ε：APADPH摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。