果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）试剂盒说明书

分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

测定原理：

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD ，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。组成：

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存，临用前加入2.8ml蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入260μl蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；

试剂四：液体16μl×1支，4℃保存，临用前加入260μl蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤和加样表：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、工作液（可测25个样）的配制：取19ml试剂一和1.26ml试剂二充分混匀；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；

3、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。

4、加样表：

试剂名称（μl）	测定管
工作液	800
样本	30
试剂三	5
试剂四	5

将上述试剂按顺序加入1 ml石英比色皿中，立即混匀，加试剂四的同时开始计时，记录在340 nm波长下20秒时的初始吸光度A1和10分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：不同匀浆组织中PFK活力不一样，做正式试验之前请做1-2只预试，若ΔA0.5，则说明活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min或5min，使ΔA0.5，以提高检测灵敏度。

PFK活力单位的计算：

1、血清（浆）PFK活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=450×ΔA

2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=450×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.225×ΔA

V反总：反应体系总体积，8.4×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。