β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒说明书

分光光度法50管/24样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。

测定原理：

β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率来计算其酶活性。

组成：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3ml蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在1.5mlEP管中依次加入下列试剂）：

充分混匀，放入37℃水浴60 min

充分混匀，95℃水浴5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，550nm处记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数），ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

β-1,3-GA活性计算：

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0958x -0.0192；x为标准品浓度（mg/ml），y为吸光值。

2、血清（浆）β-1,3-GA活力的计算

β-1,3-GA(mg/h/ml)=[(ΔA 0.0192)÷0.0958×V1]÷V1=10.438×(ΔA 0.0192)

3、细胞、细菌和组织中β-1,3-GA活力的计算

（1）按蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。

β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[(ΔA 0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr)=10.438×(ΔA 0.0192) ÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。

β-1,3-GA(mg/h /g 鲜重)=[(ΔA 0.0192)÷0.09585×V1]÷(W×V1÷V2)=10.438×(ΔA 0.0192) ÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。

β-1,3-GA(mg/h/10⁴cell)=[(ΔA 0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0208×(ΔA 0.0192)

V1：加入反应体系中样本体积，0.1ml；V2：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。