还原糖含量试剂盒说明书

分光光度法 50管/24样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、果糖和麦芽糖等，是最常见的单糖和双糖，其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物，也是进一步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。

测定原理：

加热促进碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与540nm吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、蒸馏水。

样品中还原糖的提取：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议1000万细菌或细胞加入2ml试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3S，间隔10S，重复30次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.2g组织，加入2ml试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。

3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（ml）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议取0.2ml血清（浆）加入2ml试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、调节水浴锅至95℃。

3、在EP管中加入下列试剂：

将各管摇匀，在95℃水浴中加热5min（盖紧，防止水分散失），取出后立即冷却至室温，混匀。在540nm波长下读取对照管和测定管吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

注意：如果ΔA大于2，需要将样本用试剂一稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数（若显色后出现分层现象，可改用蒸馏水稀释）。

还原糖含量计算：

1、标准条件下测定回归方程为y = 8.3796x- 0.3034；x为标准品浓度（mg/ml），y为吸光值。

2、按样本鲜重计算：

还原糖(μg/g鲜重)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(W×V1÷V2)=238.67×(ΔA＋0.3034)÷W

3、按样本蛋白浓度计算：

还原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V1×Cpr)=119.34×(ΔA＋0.3034)÷Cpr

4、按细菌或细胞密度计算：

还原糖(μg /10⁴cell)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（1000×V1÷V2）=0.239×(ΔA＋0.3034)

5、按血清（浆）体积计算：

还原糖(μg/ml)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（V3×V1÷V2）=1193.4×(ΔA＋0.3034)

1000：1mg/ml=1000μg/ml；V1：加入样本体积，0.7ml；V2：加入提取液体积，2 ml；V3：加入血清（浆体积），0.2ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；1000：细菌或细胞总数，1000万。

注意：最低检测限为1mg/g鲜重或10μg/mg prot