甲醛脱氢酶(Formaldehyde Dehydrogenase,FDH)试剂盒说明书
微量法100T/96S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物,对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一,广泛存在于原核和真核生物中,该酶能利用NAD 作为辅酶,将有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途径中的关键酶。
测定原理:
甲醛脱氢酶催化甲醛和NAD 产生NADH,在340nm处的吸光值会增加,测定340nm处的吸光值变化,可计算得到甲醛脱氢酶的活性。
组成:
产品名称 |
CE020-100T/96S |
Storage |
提取液:液体 |
100ml |
4℃ |
试剂一:液体 |
15ml |
4℃ |
试剂二:粉剂 |
1瓶 |
-20℃ |
试剂三:粉剂 |
1支 |
-20℃ |
试剂四:液体 |
1.5ml |
4℃避光 |
说明书 |
一份 |
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入6ml水溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1支,4℃保存;临用前加入1.5ml水溶解待用。
自备仪器和用品:
天平、离心机、酶标仪、96孔板、蒸馏水。
FDH提取:
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心20min。
2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3.液体:直接检测。
测定操作表:
1、酶标仪预热30min,调节波长至340nm。
2、操作表
在96孔板中加入如下试剂
测定管 |
|
样本(μl) |
20 |
试剂一(μl) |
110 |
试剂二(μl) |
50 |
试剂三(μl) |
10 |
试剂四(μl) |
10 |
混匀,于340nm下测定初始吸光值A1与5min后的吸光值A2,△A=A2-A1。
若样本数量较多,可将试剂按比例配成工作液使用。
FDH酶活计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD 的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/mg prot)= ×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 643×△A÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:每克样品每分钟催化还原1nmol NAD 的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/g 鲜重)= ×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T =643×△A÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活定义:每104个细胞每分钟催化还原1nmol NAD 的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/104cell)= ×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T= 643×△A÷细胞数量
(4)按液体体积计算
酶活定义:每ml样本每分钟催化还原1nmol NAD 的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活(nmol/min/ml)= ×V反总÷V样÷T=643×△A
:NADH微摩尔消光系数,6.22×10-3L/μmol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,0.2ml;V样:反应体系中样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T,反应时间,5min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g