二氢黄酮醇还原酶(Dihydro flavonol reductase,DFR)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶,在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。
测定原理:
二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素,可与香草醛缩合形成红色化合物,在500nm处有特征吸收峰。
组成:
产品名称 |
AO019-50T/24S |
Storage |
提取液:液体 |
50ml |
4℃ |
试剂一:液体 |
30ml |
4℃ |
试剂二:液体 |
3ml |
4℃ |
试剂三:粉剂 |
1瓶 |
4℃ |
试剂四:液体 |
40ml×2 |
4℃避光 |
说明书 |
一份 |
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加5ml蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
自备仪器和用品:
研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯。
酶液提取:
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2.液体:直接检测。
测定操作表
对照管 |
测定管 |
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酶液(μl) |
200 |
200 |
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试剂一(μl) |
700 |
600 |
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试剂二(μl) |
100 |
|||
试剂三(μl) |
100 |
100 |
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混匀,30℃反应30min |
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乙酸乙酯(μl) |
1000 |
1000 |
||
37℃震荡10min,取上层溶液,N2吹干 |
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无水乙醇(μl) |
500 |
500 |
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充分震荡 |
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试剂四(μl) |
1500 |
1500 |
||
混匀,25℃静置10min,于1ml玻璃比色皿测定500nm处吸光值A。分别记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管 |
酶活性计算公式:
标准曲线:y=0.0184x 0.0002,R2=0.999
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷W
(3)按液体体积计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫升液体每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/ml)=(△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷V样÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)
V反总:反应总体积,1ml;V样:反应体系中样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W,样本质量,g;T:反应时间,30min