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多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理：
PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。
组成：
产品名称 |
SR012-100T/48S |
Storage |
提取液：液体 |
60ml |
4℃ |
试剂一：液体 |
20ml |
4℃ |
试剂二：液体 |
5ml |
4℃ |
说明书 |
一份 |
|
自备仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）或果汁样本的处理：
按照血清（浆）或果汁体积（ml）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议取0.1ml血清（浆）或果汁加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）
试剂名称（μl） |
测定管 |
对照管 |
样本 |
50 |
|
煮沸的样本 |
50 |
|
试剂一 |
200 |
200 |
试剂二 |
50 |
|
蒸馏水 |
50 |
37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，95℃水浴5min，冷却至室温，10000g，25℃离心10min，收集上清，取200μl至微量石英比色皿或96孔板中，525nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。
注意：煮沸样本的操作：取300μl离心上清于EP管中，进行5min 95℃水浴处理；每个测定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min 95℃水浴处理。
PPO活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）或果汁PPO活性
单位的定义：每分钟每ml血清（浆）或果汁在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化
0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/ml）=ΔA×V反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液
2、组织、细菌或细胞PPO活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个
酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每g组织在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个
酶活力单位。
PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/104cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.3ml；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1ml； V样：加入样本体积，0.05ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）或果汁PPO活性
单位的定义：每分钟每ml血清（浆）或果汁在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化
0.005为一个酶活力单位。
PPO（U/ml）=ΔA×V反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液
2、组织、细菌或细胞PPO活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个
酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每g组织在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个
酶活力单位。
PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每ml反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO（U/104cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T =0.24×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.3ml；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1ml； V样：加入样本体积，0.05ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
