3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书

分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。

组成：

自备仪器和用品：

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

组织样本的前处理:

①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1ml提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1ml提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。

建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。

或培养细胞的前处理:

先收集或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照或细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万或细胞加入1ml提取液一），超声波破碎或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（3）在1ml石英比色皿中加入30μL样本、20μL试剂三和950μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

GAPDH活性计算:

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按或细胞密度计算

单位的定义：每一万个或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=2.144×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：或细胞总数，500万。