果胶酶（pectinase）试剂盒说明书

微量法100T/48S

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

果胶酶（pectinase）是一类分解果胶质酶类的总称，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于植物果实和微生物中，主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。

测定原理：

果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，具有还原性醛基，与DNS试剂反应生成红棕色物质，在540nm有特征吸收峰，测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。

试剂组成和配制：

试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；临用前加入7.5ml试剂一，50℃加热溶解，用不完的试剂4℃保存一周。

需自备仪器和用品：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3、细胞培养液等：直接检测。

测定步骤：

50℃水浴温育5min

混匀，50℃水浴反应30min

沸水浴5min，冰浴冷却终止反应，8000g，4℃，离心10min，蒸馏水调零，取上清于微量石英比色皿或96孔板测定540nm处吸光值A，△A=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

注意事项：

1、试剂二若有沉淀析出，请置于50℃加热溶解。

2、测定之前请先做预实验，如果吸光值较高或较低，请用提取液做适当的稀释或者加大样本量，并在计算公式中乘以稀释倍数或者以实际加入的样本体积参与计算。

煮沸样本建议在沸水中煮沸10分钟，以将酶彻底灭活。

酶活性计算公式：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x为标准品浓度，mg/ml；y为吸光值。

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按细胞数量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每104细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量

4．细胞培养液

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /ml）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反总：反应总体积，0.15ml；V样：反应中样本体积，0.03ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x为标准品浓度，mg/ml；y为吸光值。

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产。生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按细胞数量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每104细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量

4．细胞培养液

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/ml）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反总：反应总体积，0.15ml；V样：反应中样本体积，0.03ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h