糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b，GPb）试剂盒说明书

分光光度法50管/24样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（GPb）两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸（5^，-AMP）存在下可被激活。

测定原理：

GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映GP活性。添加一定浓度的腺苷酸（5^，-AMP）时测定GP（GPa和GPb）活性，未添加腺苷酸（5^，-AMP）时测定GPa活性，GP活性－GPa活性得到GPb活性。

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；

2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入2.5ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入2.5ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

5、试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入1.25ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37℃预热5分钟；

7、1ml石英比色皿中加入50μl样本、50μl试剂三、50μl试剂四、50μl蒸馏水和800μl工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2，计算ΔAGPa=A2-A1。

8、在1ml石英比色皿中加入50μl样本、50μl试剂三、50μl试剂四、50μl试剂五和800μl工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A3和10min后的吸光值A4，计算ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每个样本需要同时测一个GP（GPa和GPb）活性和一个GPa活性，因此本试剂盒50管测24个样本。

GPb活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。