木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）试剂盒说明书

分光光度法50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。

测定原理：

木质素过氧化物酶催化天青脱甲基，在651nm处测定吸光值减少。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入80ml蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存1个月；

需自备仪器和用品：

天平、研钵、低温离心机、分光光度计、1 ml玻璃比色皿、可调式移液器、冰。

酶液提取：

1、组织：按照质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1ml试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3、培养液或其它液体：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至651nm，蒸馏水调零。

2、临用前按每个样本试剂一：试剂二：试剂三= 400:200:200（μl）的比例配制工作液，现配现用。

3、在1ml玻璃比色皿中依次加入如下试剂

	测定管
样品（μl）	200
工作液（μl）	800

充分混匀，立即测定651nm处10s和130s吸光值，记为A1和A2，△A=A1- A2

酶活计算公式：

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每mg组织蛋白在每ml反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.02÷T =125×ΔA÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每g组织在每ml反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.02÷T =125×ΔA÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每1万个细菌或细胞在每ml反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/104 cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.02÷T =0.25×ΔA

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每ml血清（浆）在每ml反应体系中每分钟A651变化0.02为一个酶活力单位。

LiP活性（U/ml）=ΔA×V反总÷V样÷0.02÷T =125×ΔA

V反总：反应总体积，1ml；V样：反应中样本体积，0.2ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，2min