线粒体转氢酶-1(TH-1)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
TH位于线粒体的内膜上,又称为呼吸电子传递链复合体六,催化NADH NADP 和 NAD NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H 电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。
测定原理:
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP )替代NADP ,TH-1催化 APADP 还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收,因此通过测定375nm光吸收增加速率,来计算TH-1活性。
试剂的组成和配制:
产品名称 |
OP018-50T/48S |
Storage |
试剂一:液体 |
50ml |
-20℃ |
试剂二:液体 |
25ml |
-20℃ |
试剂三:液体 |
25ml |
4℃ |
试剂四:粉剂 |
2支 |
-20℃ |
试剂五:液体 |
2支 |
-20℃ |
说明书 |
一份 |
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
组织、或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、准确称取0.1g组织或收集500万或细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g,4℃离心5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-1(此步可选做)。
5、步骤4中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-1活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液的配制:临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支,将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
TH-1活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=164×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=82×ΔA÷W
(3) 按或细胞密度计算
单位的定义:每1万个或细胞每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.164×ΔA
V反总:反应体系总体积,1.1×10-3 L;ε:APADPH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1 mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:或细胞总数,500万。