Na K - ATP酶活性测定说明书

分光光度法 50管/24样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Na K - ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。

测定原理：

Na K -ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。

试剂的组成和配制：

试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加1ml蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周；

试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周；

0.5μmol/ml 标准磷应用液配制：将贮备液 20倍稀释，即取 0.1ml试剂十加1.9ml蒸馏水充分混匀。

定磷剂的配制：按H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样品酶液的制备：

1、、细胞或组织样品的制备：

或培养细胞：先收集或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万或细胞加入1ml提取液），超声波破碎或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤:

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）：

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min;

混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液;

3、定磷(在1.5mlEP管中依次加入下列试剂)

混匀，室温放置30 min，在 660nm处比色。

注意:

1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管保证测 24份Na K -ATP酶。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。

3、空白管和标准管只要做一管。

计算:

1、血清（浆）Na K - ATPase活力的计算:

定义：每小时每毫升血清（浆）中Na K - ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Na K -ATP酶活力（μmol/h/ml）=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）

2、组织、或细胞中Na K - ATPase活力的计算：

（1）按蛋白浓度计算：

定义：每小时每毫克组织蛋白中Na K - ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Na K -ATP酶活力(μmol/h /mg)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（Cpr×V样）÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

定义：每小时每克组织中Na K -ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Na K -ATP酶活力(μmol/h/g)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W

（3）按或细胞密度计算：

定义：每小时每1万个或细胞中Na K -ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Na K -ATP酶活力(μmol/h /10⁴)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）

C标准管：标准管浓度，0.5μmol/ml；V总：酶促反应总体积，0.5ml；V样：加入样本体积，0.2ml ；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g；500：或细胞总数，500万。