己糖激酶(hexokinase，HK)试剂盒说明书

分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理：

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

组成：

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入30ml蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入4ml蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2ml蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μl试剂一和250μl蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

1、或培养细胞：先收集或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万或细胞加入1ml提取液），超声波破碎或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三、四和五37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。

3、加样表：

将上述试剂按顺序加入1 ml石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、为了减小操作误差，建议将试剂一、二、三、四、五按比例配成混合液，预热10min，取30μl样本 8μl试剂六 1ml混合液，混匀后按照上述步骤检测。

2、不同匀浆组织中HK活力不一样，做正式试验之前请做1-2只预试，若ΔA0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min,使ΔA0.5，以提高检测灵敏度。

HK活性计算：

1、血清（浆）HK活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=1113×ΔA

2、组织、或细胞中HK活性

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1113×ΔA÷W

（3）按或细胞密度计算

单位的定义：每1万个或细胞每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK（nmol/min /10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=2.226×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.038×10^-3L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：或细胞总数，500万。