上海跃腾生物技术有限公司
酸性木聚糖酶（Acidic Xylanase，ACX）测定试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，ACX一般分离自耐酸的真菌，细菌及部分霉菌。
测定原理：
ACX在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，进一步在沸水浴条件下与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算ACX活力。
组成：
产品名称 |
GMS057-100T/48S |
Storage |
缓冲液：液体 |
90ml |
4℃ |
试剂一：液体 |
10ml |
4℃避光 |
试剂二：液体 |
10ml |
4℃避光 |
说明书 |
一份 |
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试剂一：液体10ml×1瓶，4℃避光保存。（若出现白色絮状或颗粒状沉淀，可60℃加热溶解后使用）。
自备仪器和用品：
天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
粗酶提取：
1.发酵液：发酵液于8000g，4℃，离心15min，取上清，作为待测样品。
2.酶干粉：称约0.1mg，加1ml缓冲液溶解待测。
3.组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml缓冲液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清待测。
测定操作表：
1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至540nm。
2、操作表
对照管 |
测定管 |
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样品（μl） |
60 |
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灭活的样品（μl） （95℃水浴15min） |
60 |
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缓冲液（μl） |
90 |
90 |
试剂一（μl） |
60 |
60 |
混匀，50℃水浴中反应30min，立即沸水浴中10min灭活。(注意不要让盖子爆开，以免进水，改变了反应体系) |
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试剂二（μl） |
90 |
90 |
混匀，沸水浴显色5min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中540nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。 |
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ACX计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 2.5554x - 0.002 ，R2= 0.9983
1. 按液体体积活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/ml）= （ΔA 0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106
= 435× (ΔA 0.002)
2. 按蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA 0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106÷Cpr
= 435×(ΔA 0.002 ) ÷Cpr
3. 按鲜重计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/g鲜重）= （ΔA 0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×106÷W
= 435×(ΔA 0.002 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V反总÷V样=300μL÷60μL=5；
106：转化因子，即1mg/ml=106ng/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 1.2777x - 0.002 ，R2= 0.9983
1. 按液体体积活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/ml）= （ΔA 0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×106
= 869.6× (ΔA 0.002)
2. 按蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA 0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×106÷Cpr
= 869.6×(ΔA 0.002 ) ÷Cpr
3. 按鲜重计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/g鲜重）= （ΔA 0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×106÷W
= 869.6×(ΔA 0.002 ) ÷W
150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V反总÷V样=300μL÷60μL=5；
106：转化因子，即1mg/ml=106ng/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g。
注意事项：
1. 吸光度变化应该控制在0.01～0.8之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2. 试剂盒2-8℃保存，保质期3个月，建议尽快使用。
