NAD-苹果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）试剂盒说明书

分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P) 的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理：

NAD-ME催化NAD 还原成NADH，在340nm下测定NADH增加速率。

组成：

试剂三：粉剂×1支，4℃保存；用时加2ml蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；用时加1ml蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿和蒸馏水。

样本的前处理：

1、、细胞或组织样品的制备：

或培养细胞：先收集或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万或细胞加入1ml提取液），超声波破碎或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三和四置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。如果一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上（现配现用）。

3、操作表：

试剂名称（μl）	测定管
试剂一	600
试剂二	225
试剂三	30
试剂四	15
样本	30

将上述试剂按顺序加入1 ml石英比色皿中，混匀，立即记录 340 nm波长下初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：如果ΔA＜0.005，可将反应时间延长到2分钟或5分钟。

NAD-ME活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 4823×ΔA÷W

（3）按或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T =9.646×ΔA

V反总：反应体系总体积，9×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：或细胞总数，500万。