线粒体活性氧产生速率(ROS)检测试剂盒说明书

荧光法100T/96S

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，研究表明，机体95％以上的活性氧（ROS）都来自于线粒体，其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。

正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态，细胞内活性氧（ROS）水平维持在较低的生理范围；在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破，细胞内活性氧水平过多，就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，同时，活性氧还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。

因此，通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。

测定原理：

荧光探针-还原型二氯荧光素 (2", 7"-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可扩散通过线粒体膜，在线粒体内被酯酶水解，形成无荧光的DCFH，DCFH迅速与ROS反应生成荧光物—氧化型二氯荧光素(2", 7"-dichlo rofluorescin, DCF)。 根据上述原理设计了利用荧光法直接定量检测线粒体ROS产生速率的方法。将荧光强度随时间变化的数据点拟合，线性回归直线斜率与ROS产生的速率呈正比。

组成：

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6 ml试剂二充分溶解；

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6 ml试剂二充分溶解；

试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6 ml试剂二充分溶解；

试剂七：液体×1瓶, 保存；临用前用试剂二稀释300倍后使用；

自备仪器和用品：

多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。

线粒体提取：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将上述匀浆液于600g（离心率），4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、弃上清，沉淀中加入200μl试剂二重悬。

测定步骤：

1、多功能酶标仪预热30min以上，调节激发光499nm，发射光521nm。

2. 在黑色不透光96孔板中加入下列试剂

孵育完成后，在37℃恒温下测定10min内荧光强度，激发波长499nm，发射波长521nm，记录10min内的荧光值变化。

ROS产生速率计算：

对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理 ,计算出回归系数,即直线斜率（k）。实际线粒体ROS产生速率等于样本荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率(k测定)减去本底荧光强度随时间变的数据点线性回归直线斜率（k空白）。

(1)按样本鲜重计算：每g组织线粒体每秒钟荧光单位的变化,即u/ s/g 鲜重

ROS产生速率(u/ s/g鲜重)=(k测定-k空白)/(V样÷V总×W）=10×(k测定-k空白)÷W

(2)按样本蛋白浓度计算：每毫克蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化u/ s/mg prot。

ROS产生速率(u/ s/ mg prot)=(k测定-k空白)/(V样÷V总×Cpr）=10×(k测定-k空白)÷Cpr

V样：加入样本体积，0.02 ml；V样总：悬液体积，0.2 ml；W: 样本鲜重，g；Cpr: 样本蛋白浓度，mg/ml。