二氢黄酮醇还原酶(Dihydro flavonol reductase,DFR)试剂盒说明书
微量法100T/48S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶,在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。
测定原理:
二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素,可与香草醛缩合形成红色化合物,在500nm处有特征吸收峰。
组成:
产品名称
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AO020-100T/48S
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Storage
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提取液:液体
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100ml
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4℃
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试剂一:液体
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12ml
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4℃
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试剂二:液体
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1.5ml
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4℃
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试剂三:粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂四:液体
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30ml
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4℃避光
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说明书
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一份
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试剂三:临用前加2ml蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
自备仪器和用品:
研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯。
酶液提取:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定操作表:
1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至500nm。
2、操作表
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对照管
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测定管
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酶液(μl)
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40
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40
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试剂一(μl)
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140
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120
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试剂二(μl)
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20
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试剂三(μl)
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20
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20
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混匀,30℃反应30min
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乙酸乙酯(μl)
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200
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200
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37℃震荡10min,取上层溶液,N2吹干
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无水乙醇(μl)
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100
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100
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充分震荡
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试剂四(μl)
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300
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300
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混匀,25℃静置10min,于微量石英比色皿/96孔板中测定500nm处吸光值A。分别记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管
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计算公式:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.0184x+0.0002,R2=0.999
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0184×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷W
V反总:反应总体积,1ml;V样:反应体系中样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W,样本质量,g;T:反应时间,30min
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.0092x+0.0002,R2=0.999
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/mg prot)=(△A-0.0002)÷0.0092×V反总÷(V样×Cpr)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在30℃,pH7.5条件下,每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR活性(mmol/min/g 鲜重)= (△A-0.0002)÷0.0092×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T÷2
= 9.06×(△A-0.0002)÷W
V反总:反应总体积,1ml;V样:反应体系中样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W,样本质量,g;T:反应时间,30min