山东万象环境科技有限公司
核酸DNA提取试剂盒（柱膜法）使用说明书
【产品名称】
通用名称：病毒DNA提取试剂盒
英文名称：Extraction Kit for Virus DNA
【预期用途】
本试剂盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、组织、饲料及环境中的病毒DNA的提取，纯化的核酸可适用于各种常规操作及PCR试验。
【试剂盒组分】
I、试剂盒组成及贮藏条件
名称 |
20T |
50 T |
1、吸附柱 |
20个 |
50个 |
2、收集管 |
20个 |
50个 |
3、裂解液 |
5mL |
11 mL |
4、洗液I |
13mL |
32 mL |
5,洗液II |
13mL |
32 mL |
6.洗脱液 |
1.2 mL |
3 mL |
2、保存条件及有效期：室温下保存，有效期12个月.
3、 需自备材料：无水乙醇、1.5 mL无菌离心管、1.5 mL无菌离心管（长臂型）、生理盐水、研钵、无菌
1mL, 2OOuL、10uL枪头、记号笔等。
【操作步骤】
一、样品制备
1、血液样品：抗凝血样品置离心管中，8000转/分钟离心2分钟，取上层血浆；非抗凝血样品置离心管中，待凝固后，8000转/分钟离心2分钟，取上层血清，置于灭菌离心管中，编号待检。
2、组织样品：采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体等病变组织样品0.1g.组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入1 mL生理盐水混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心骨中，编号待检。
3、口腔液：进食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉线绑纱布团吸引动物咀嚼，收集口腔液大于500uL，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检。
4、饲料：取适量研磨后的饲料（约0.2g），放入含1 mL生理盐水或PBS（PH为7.4）缓冲液的2 mL EP管屮，振荡混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中,编号待检.
5、灰尘：用无菌棉签蘸取适量环境表面上的灰尘，放入含1mL生理盐水或PBS（PH为7.4）缓冲液的2 mLEP管中，振荡混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检。
二、DNA的提取
1、取裂解液200uL加入无核酸酶1.5 mL离心曾屮，分别加入血浆/血清/组织液等样品液200uL. 震荡混匀10秒或颠倒混匀10次，室温放置5分钟（如果室内温度较低时.需放置25C水浴温育），再加入200uL无水乙醇，颠倒混匀10秒；若样品浑浊则先12000转/分钟离心1分钟处理，取上清液，以避免堵塞柱子；
2、将液体转入套有收集管的吸附柱中，12000rpm离心1分钟：
3、弃收集管液体，向吸附柱中加600uL洗液I ,12000 rpm离心1分钟;
4、弃收集管液体，向吸附柱中加600uL洗液II，12000 rpm离心I分钟；
5、弃收集管液体，12000 rpm离心2分钟，以彻底去除残留洗液；
6、将吸附柱转入新的无核酸酸1.5mLEP管（长臂型）中，向柱中央滴加50 uL洗脱液，静置1分钟, 12000 rpm离心1分钟，EP管中液体即为病毒DNA。
【注意事项】
1、实验前诺仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行.在操作过程中对时间、试剂体积等 粘确控制可以获得最好的结果。
2,样本应新鲜采集使用，或低温运输储存；
3,样本具有潜在感染风险，核酸的提取应在核酸提取实验室的生物安全柜中进行。
4、核酸提取冇关耗材确保高温灭菌，提取后核酸尽快进入下一步试验或冷冻保存待用。
5,试剂使用前应混合均匀，试剂具有一定腐蚀性，使用时请戴手套、口罩做好防护。
6.低温下裂解液出现结晶数属正常现象，可在60°C水浴加热助溶后使用。
7、实验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。
仅供兽医诊断使用
非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明书
【兽药名称】
通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒
汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe
英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit
商品名称：无
【主要成分与含量】试剂盒中含有如下组分:
试剂盒组分 |
含量 |
阳性对照 |
250μL/管×1管 |
阴性对照 |
250μL/管×1管 |
PCR反应液 |
850μL/管×1管 |
萌混合液 |
150μL/管×1管 |
说明书 |
1份/盒 |
【作用与用途】 本试剂盒可用于血液、脾脏、肝脏、淋巴结、 样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。 扁桃体、肾脏、肌肉、环境样品等 |
|
【用法与判定】
1 用法
1.1待检样品釆集、保存及运输
1.1.1样品釆集
（1）活猪样品无菌采集抗凝血或血清5mL
（2）病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2?8°C低温运至实验室用于检测。
（3）病猪污染的周边环境采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。2?8°C低温运至实验室用于检测。
1.1.2样品保存采集的样品在2?8°C保存应不超过24小时，-70°C条件下保存，避免反复冻融。
1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输管理的有关规定。
1.2样品处理
1.2.1血液样品处理抗凝血样品置于离心管中，8000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号待检。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟取200μL上层血清，编号待检。
1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，再加适量生理盐水混匀，制成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。
1.2.3环境样品处理
1.2.3.1粪便、饲料样品处理方法取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨混匀，制成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。
1.2.3.2污水样品处理方法直接取200μL污水进行核酸提取。
1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法进行DNA核酸提取。
1.4荧光PCR反应：
1.4.1从试剂盒中取出荧光PCR反应液、酶混合液，室温融化后，2000 r/min离心5秒。设被检样品、阳性对照和阴性对照总和为n,则反应体系配制如下：
试剂体系
PCR 反应液 17× (n 1) μL
酶混合液3× (n 1) μL
1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20μL/ 管分装量将试剂分装至荧光PCR反应管。
1.4.3在上述制备好的荧光PCR反应管中分别加入阴性对照、阳性对照各5μL、处理好的待测核酸各5μL,终体积25μL/管，盖好荧光PCR反应管盖，混匀后瞬时离心，转移到荧光PCR仪器上。
144将PCR反应管放置在荧光PCR仪样品槽中，在荧光PCR仪上运行以下程序：
步骤 |
条件 |
循环数 |
UNG处理 |
50℃,2分钟 |
1 |
预变性 |
95℃,3分钟 |
1 |
预扩增 |
95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒 |
5 |
PCR扩増 |
95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒 |
40 |
荧光通道选择FAM,在PCR扩增阶段每个循环的55℃时采集荧光信号。设置扩增体系为25μL, 同时要选择passive reference和quencher为none的模式。（注：若荧光PCR仪（如AB17500）按说明书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行，可将预扩增和PCR扩增条件变更为95C：5秒55°C：30 秒）
2结果判定
2.1试验有效性判定
阳性对照有典型扩增曲线且Ct值≤30.且阴性对照无Cl值或无扩增曲线，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。则判试验结果有效。否则，此次试验视为无效。
2.2样品判定
2.2.1阳性：样本检测结果Ct值≤35且有明显指数增长期，判定检出非洲猪瘟病毒核酸。
2.2.2可疑：样本检测结果Ct值在35?38范围内。此时应对样本进行重复检测，如果重复实验结果Ct值仍在35?38范围内，有明显指数增长期.则判定为阳性，否则为阴性。
2.2.3阴性：样本检测结果Ct值＞38或无Ct值，判定未检出非洲猪瘟病毒核酸。
【注意事项】（1）实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得最好的结果。
（2） 实验室应严格按照有关规定分区管理，依照配液区-模板提取区-扩增区-分析区顺序进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。
（3） 核酸提取有关耗村确保洁净、无DNase/RNase,提取过程尽量低温、快速，完成后进入下一步实验或冻保。
（4） 对于顶部采光仪器要带新的一次性PE手套对荧光PCR管封盖，对于底部采光仪
器要避免徒手或使用过的手套接触荧光PCR管底，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。
（5）冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底。避免反复冻融，以免影响试剂性能。
（6）样品、阳性对照等在使用后及时封盖，.避免组分间及气溶胶等的污染造成假阳性。
（7） 扩增产物禁止开盖，实验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。
【规格】50头份/盒
【贮藏与有效期】试剂盒置-20°C以下避光保存，有效期12个月。
【批准文号】兽药生字163668871
【生产企业】郑州中道生物技术有限公司
仅供兽医诊断使用
