【产品名称】

通用名称：古典猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒

英文名称：Classieal Swine FevervirusRT-PCR Detection Kit

【包装规格】10头份/盒50头份/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于古典猪瘟病毒检测，不进行病毒分型，对古典猪瘟病毒引起的流感及其并发症的诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，终于使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的扩增带。

【主要组成成份】

组成	10头份/盒	50头份/盒
CSFVRT-PCR反应液	150 μL×1管	750μL×1管
CSFV混合酶液	30 μL×1管	150 μL×1管
CSFV阳性对照	40 μL×1管	40 μL×1管
CSFV阴性对照	40 μL×1管	40 μL×1管
0.2 mL薄壁PCR管	12个	60个
50倍TAE电泳缓冲液（50倍稀释后使用）	20 ml	100 ml
染色液	20 μL	50 μL
上样缓冲液	40 μL	200 μL
制备管	10个	50个
2 ml离心管	20个	100个
1.5 ml离心管	10个	50个
Buffer V-L（病毒裂解液）	2.4 ml	12 ml
Buffer V-N（蛋白去除液）	0.8 ml	4 ml
Buffer W1A concentrate（洗涤液）	4.8 ml	24 ml
Buffer W2 concentrate（去盐液）	4.8 ml	24 ml
Buffer TE（nuclease-free）	0.8 ml	4 ml
说明书	1份	1份

注：阴性对照为猪基因组DNA，阳性对照为失去活性的古典猪瘟病毒cDNA。

【储存条件及有效期】-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。

【需自备的物品】

1.仪器：分析天平、离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、-20℃冰箱、可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。

2.耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌1.5mL离心管和吸头（10μL、200μL、1000μL）、灭菌双蒸水。

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力，操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他DNA/RNA的污染而出现假阳性，必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套，操作人员须戴口罩。

4.Buffer V-L、Buffer V-N和Buffer W1A含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。

【实验准备】

第一次使用时，请在BufferW1A和BufferW2concentrate中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇；

准备异丙醇（1%冰乙酸）：即99ml异丙醇中加入1ml冰乙酸，混合均匀，室温密闭储存；

如果是提取病毒RNA，请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

【操作步骤】

1.样品处理：每份样品分别处理。

（1）.血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。

（2）.肌肉或内脏样品：取少量样品（2～3克）于研钵或匀浆器中研磨，然后将研磨匀浆转入无菌离心管中，3000rpm/min离心10分钟取上清待检。

（3）.应避免标本间交叉污染。

（4）.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻

2.提取过程：

（1）向上一步转入样品的1.5 mL的离心管中，加入200 μL Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀，静置5 min。

（2）加入75 μL Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀后，于12,000 rpm离心5 min。

（3）将上清液转移到新的2mL离心管（试剂盒内已提供）中，加300 μL异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均匀。

（4）将制备管置于2ml离心管（试剂盒内提供）中，取上一步骤中的混合液移入制备管中，6,000 rpm离心1 min。

（5）弃滤液，将制备管放回到2 ml离心管中，加入500 μL Buffer W1A（确认已按要求加入无水乙醇），室温静置1min，于12,000rpm离心1 min。

（6）弃滤液，将制备管放回到2 ml离心管中，加入800 μL Buffer W2（确认已按要求加入无水乙醇），于12,000 rpm离心1 min。

（7）将制备管放回到2 ml离心管中，12,000 rpm离心1 min。

（8）将制备管置于洁净的1.5 ml离心管（试剂盒内已提供）中，在制备管膜中央加入40-60 μL Buffer TE（nuclease-free），室温静置1min，于12,000rpm离心1-2min洗脱DNA/RNA。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要DNA/RNA浓度较高，可以将洗脱的DNA/RNA再次过柱离心洗脱一次；或适当减少洗脱体积， 但是体积不应少于30 μl，体积过小降低洗脱效率，减少RNA产量。

3. RT-PCR扩增

每份总体积20 μL，含15 μL RT-PCR反应液（用前混匀），3μL混合酶液，2μL模板RNA。

例如：n份样品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反应液，3×（n+1）混合酶液匀后取18 μL分装成n份，分别加入2μL模板RNA，作好标记。

在PCR扩增仪上进行以下程序：50 ℃10 min，94℃3min；循环94℃30 s，55℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸7min。

4.电泳

称1.5 g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液100mL（取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至100mL），于微波炉中熔解，再加入50 μL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10 μL点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

【结果判定】

阳性对照出现232 bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现232 bp扩增带为古典猪瘟病毒阳性，否则为阴性。