RIPA裂解液（强，含PMSF）

简介：

RIPA主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。RIPA裂解液（强）(Enhanced RIPA lysis buffer ,without inhibitors)是采用一种经典的细胞组织快速裂解，并获得总蛋白的裂解液，其裂解强度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(中)。

伊势久RIPA裂解液（强，含PMSF）的主要由NP-40、deoxycholate、SDS组成，含蛋白酶抑制剂。由于含有较高浓度的去垢剂，因此不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

组成：

存储条件：

RIPA裂解液保存于2~8℃。12个月有效期。

操作步骤(仅供参考)：

无需配制，直接使用。

(一)贴壁培养细胞

1、 取Enhanced RIPA lysis buffer室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加抑制剂。

2、 去除贴壁细胞的培养液，低速离心，弃上清。

3、 按照6孔板每孔加入150～250 ul含有PMSF的裂解液的比例，加入RIPA Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解。通常裂解液作用于细胞1～3秒内，细胞就会被裂解。

4、 离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞

1、 取Enhanced RIPA Lysis Buffer室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加抑制剂。

2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、 用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250 ul裂解液的比例，加入Enhanced RIPA Lysis Buffer。

4、 离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

5、 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)组织样本

1、 取Enhanced Lysis Buffer置于室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加抑制剂。

2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取在液氮或超低温冰箱中冷冻以上的组织，迅速 用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2 min之内，以减少蛋白的降解。

3、 按照每20 mg组织加入150～250 ul 裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解。

4、 离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项：

1、 去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2、 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3、 如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。

4、 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。

5、 溶解伊势久RIPA Lysis Buffer时，应尽量缩短溶解时间，避免有效成分失效。

6、 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。

7、 细胞裂解的操作步骤，应在低温环境下进行。