非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒说明书(探针法)
50头份/盒
作用与用途:
用于猪脾脏、淋巴结、肉品、血液及血液制品中病毒核酸的检测。
用法与判定:
1.用法
1.1样品处理:以下样品处理后置60℃灭活30分钟。
1.1.1组织样品:取100mg-200mg待检组织样品(脾脏、淋巴结、肉品),用研钵或者组织匀浆仪充分研磨匀浆后,加入1ml PBS(pH7.2)混匀;然后以1000r/min离心3分钟,吸取200ul上清,置于1.5ml离心管中,编号备用。
1.1.2血液:采集抗凝血,吸取200ul,置1.5ml离心管中,编号备用。
1.1.3血液制品:取100mg-200mg待检血液制品(如血浆蛋白粉),置于1.5ml离心管中,加入1ml PBS(pH7.2),充分混匀震荡后,以10000r/min离心3分钟,吸取200ul上清,置于1.5ml离心管中,编号备用。
1.2样品存放:采集或处理好的样品在2-8℃保存应不超过24小时;若需长期保存,须放置-70℃以下冰箱,并应避免反复冻融。
1.3 DNA提取:用商品化试剂盒按其说明书,对处理好的样品提取DNA。
1.4 荧光PCR反应体系的配置:取出试剂盒中的各组分,置室温(15-25℃)融化后瞬时离心,备用。每次检验设阴、阳性对照。设待检样品、阳性对照和阴性对照的样品总份数为n,按如下反应体系配置:
2 X qPCR Mix
|
12.5ul x(n+1)
|
引物探针预混液
|
7.5ul x(n+1)
|
总量
|
20ul x(n+1)
|
将以上配置的反应体系充分混匀后,按20ul/管分装至反应管中。分别取DNA样品5ul加入相应反应管中,盖紧管盖后瞬时离心。
1.5 荧光PCR反应条件:
温度
|
时间
|
循环数
|
说明
|
是否收集信号
|
95℃
|
3min
|
1cycle
|
预变性
|
否
|
95℃
|
15sec
|
40-45cycle
|
变性
|
否
|
60℃
|
30sec
|
退火,延伸
|
是(FAM)
|
对于ABI荧光PCR仪,选择FAM通道读取检测结果,淬灭基团选择“MGB”;
对于其它品牌的荧光PCR仪,选择FAM通道读取检测结果,淬灭基团选择“None”
本产品使用特殊的ROX Reference Dye,适用于所用qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX的浓度。
2.试验成立条件:
阳性对照Ct值≤35并出现典型的扩增曲线,阴性对照无Ct值或无典型的扩增曲线,则判为试验成立。
3.判定:
待检测样品Ct值≤35并出现典型的扩增曲线,判为阳性;待检样品无Ct值或35<Ct值≤40并且无典型的扩增曲线,判为阴性。
注意事项
1.试剂盒应在-20℃以下保存和运输。
2.本试剂盒仅用于科研检测使用,操作人员必须经过培训,试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。
3.不要使用过期组分或者不同批次组分混合使用。
4.使用时尽量避免反复冻融,如冻融,应不超过3次。
5.样品采集和处理过程应戴一次性手套,并及时更换,样品间严禁交叉污染。
6.荧光PCR实验严格分区操作,各区应有专用的手套、移液器等,不得交叉使用,避免污染;工作人员应遵循单方向工作原则,各工作区相对隔离。
7.进行荧光PCR实验的工作桌面及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸依次灭菌和消毒,或定期用紫外灯灭菌和消毒。
8.测试样品时,应做好生物安全防护。
9.试验完毕后,使用过的试剂盒、样品和试剂应进行无害化处理。