一、概述

G-Oligo (dT)25磁珠用于从总 RNA或直接从动物组织、植物细胞中快速分离出高纯度且完整的mRNA。可以广泛应用到各种样品中。磁珠上的 oligo-dT 与 mRNA的 polyA杂交，仅需几步洗涤、洗脱和磁分离，即可获得高纯度的mRNA。所有操作都在单管中一次完成，操作简单易行。

二、产品特性

粒径：200 nm

结合能力：~2 ug mRNA/mg bead

（注意：每mg磁珠可纯化~ 2 μg mRNA.一个典型动物细胞含10–30pg的RNA，其中1–5%是mRNA.每mL磁珠可纯化10μg的mRNA，若磁珠重复利用5次，则每mL磁珠可纯化50μg的mRNA。）

浓度：5 mg/mL

保存液：0.1 M Tris-HCl，pH 7.5, 20 mM EDTA，含0.1%（v/v）Tween -20，0.1%（w/v）NaN3

储存：2~8 °C保存，勿冻结。常温运输，正确使用保存期一年。

三、缓冲液

结合缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA.

裂解/结合缓冲液：100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT).

洗涤液A：10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS.

洗涤液B：10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.

四、注意事项

实验操作：在进行RNA实验时，必须注意要抑制RNase的作用。因此，除了要防止通过使用器具以及试剂中混入RNase，即注意实验环境之外，还要防止通过唾液、汗等混入RNase，建议戴上口罩和手套。

器材：在实验器材允许情况下，对一次性塑料制品高温高压湿热灭菌处理。在使用玻璃器皿的情况下，请干热灭菌，或在0.1% DEPC溶液中，37℃下浸泡12h，再高温高压湿热灭菌（121℃，30分钟）。

五、操作流程

1.磁珠预处理

（1）将磁珠悬液漩涡振荡30 s，使磁珠充分重悬；

（2）取出100 μL磁珠悬液至1.5 mL EP管中；磁分离，移去上清液，从磁分离器上取下反应管；

（3）加入1mL结合缓冲液重悬磁珠，用移液器缓慢吹打5~10次或漩涡震荡30 s，磁分离，去上清。

（4）加入100 μL结合缓冲液重悬磁珠。

2.样品前处理

对应样品	样品量	磁珠量
动物组织	~50 mg	100μL
植物组织	~100 mg	100μL
培养细胞	~1×107	100μL
总RNA	~100μg	100μL

（1）动物/植物组织

a. 将所需量的植物或动物组织在液氮中研磨成粉末，保持冷冻状态，避免RNA降解。

b. 将一定量（参考样品对照表）冷冻粉收集并转移到新的EP管中，添加1mL裂解/结合缓冲液，匀浆器匀浆1-2min至裂解完全。该步骤尽量快速操作，避免mRNA降解。

c. 在室温下以14,000rpm离心1 min，并将所有上清液转移至一个新的EP管。上清液可用于mRNA纯化，或保存在-80℃备用。

（2）细胞悬浮液

a. PBS缓冲液中清洗细胞，室温下以4,000rpm离心5min沉淀细胞并丢弃上清液。

b. 每1-4×106个动物或植物细胞加1ml裂解/结合缓冲液。通过移液吹打多次裂解细胞至溶液变粘稠。

c. 通过DNA剪切降低粘度。用1-2注射器通过21#针头三次吸入和吸出剪切裂解液中的DNA来降低溶液粘度。可能会产生泡沫，但不影响mRNA的得率。

d. 在室温下以14,000rpm离心5min，并将所有上清液转移至一个新鲜的EP管。上清液可进行mRNA纯化，或保存在-80℃以备将来使用。

3.提取mRNA

a. 制备动物/植物组织裂解液或从培养细胞和细胞悬浮液中制备裂解液。

b. 对磁珠进行预处理。

c. 将裂解液与磁珠混合（参考样品对照表），室温下旋转混合3-5分钟。

d. 磁分离，静置2min，去上清。

e. 室温下分别用1ml洗涤液A和1ml洗涤液B清洗磁珠，去除可能的污染物。

f. 进入如下之一操作：

如果分离mRNA用于酶促下游应用（例如固相cDNA合成），洗涤液B（500μL）洗涤一次，随后用酶缓冲液洗涤一次，可用于下游应用。

如从磁珠中洗脱mRNA，洗涤液B洗涤后并加入10～20μl的10mMTris-HCl，75~80°C孵育2min，然后快速将含mRNA的上清转移到新RNase-free的EP管。

4. Total RNA中纯化mRNA

（以纯化75ug Total RNA中mRNA为例）

a. 取100uL含有75ug Total RNA 与100uL结合缓冲液混合。（若Total RNA含量低于75ug/100uL，直接混合；若Total RNA含量高于75ug/100uL，用DEPC水稀释至75ug/100uL后混合）

b. 65°C孵育2min，打开RNA二级结构，结束后迅速置于冰上。

c. 将200 uL混合液与100 uL洗涤后磁珠在室温下旋转混合3-5min。75ug Total RNA对应1mg磁珠，磁珠应预先洗涤并重分散在100 uL结合缓冲液中。

d. 磁分离，静置2min，去上清。

e. 室温下分别用200 uL洗涤液B清洗磁珠，磁分离，去上清。重复该步骤1次。

f. 加入10～20μl 的10mM Tris-HCl，75~80°C孵育2min，然后快速将含有mRNA的上清液转移到新的RNase-free的EP管。

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