1.简介

羧基磁珠是常用的偶联载体，本试剂盒提供用于羧基与氨基的偶联所需的缓冲液，譬如羧基微珠偶联抗体、氨基修饰DNA等。

2.试剂盒组成

缓冲液	体积	组成	注意
Coupling Buffer （偶联缓冲液）	50 ml	50 mM MES, pH 6.0, 0.01% Triton X-100
Coupling Agent （偶联试剂）	50mg×1	EDC；50 mg/ml×1ml（用前加入1ml Coupling Buffer）	尽量现配现用，溶液保存不超过1个月
	50mg×1	Sulfo-NHS；50 mg/ml×1ml（用前加入1ml Coupling Buffer）	尽量现配现用，溶液保存不超过1个月
Quench Buffer （淬灭缓冲液）	50 ml	TBS (25 mM Tris-Cl, 130 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 8, 0.01% Triton X-100;
Storage Buffer （储存缓冲液）	10 ml	TBS or PBS containing 0.01% Triton X-100 or 0.01% Tween 20, 0.05%NaN3.

3.两步偶联方案

本方案通过加入稳定胺反应性中间体的sulfo-NHS来增加EDC介导的反应的效率。本方案中涉及的偶联对象（蛋白、氨基修饰核酸、其它含伯氨基化合物）的使用量可根据需要进一步优化以达到最优偶联率。

1. 确保蛋白或配体在无胺偶联缓冲液中。100μL偶联缓冲液中需50?400μg蛋白用于偶联。

2. 涡旋振荡重悬羧基磁珠。吸取100μL磁珠到1.5mL的EP管中，磁分离并吸弃上清。

3. 加入200μL偶联缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。

4. 按步骤3再清洗羧基磁珠两次。

5. 使用前用偶联缓冲液配制EDC（50 mg / mL）。使用前用偶联缓冲液配制Sulfo-NHS（50mg / mL）。

6. 向磁珠中加入60μL偶联缓冲液、20μL新配的EDC溶液和20μL新配的Sulfo-NHS溶液。混匀。

7. 室温下混匀孵育15分钟。磁分离并吸弃上清。

8. 用200μL偶联缓冲液清洗磁珠。涡旋混匀，磁分离并吸弃上清。

9. 加入100μL偶联缓冲液和50?400μg蛋白或配体。涡旋混匀。室温下连续混合孵育0.5?4小时。

10. 将试管放入磁力架，磁分离吸弃上清。该上清液含未结合的配体，如优化方案可保存用于分析。

11. 向羧基磁珠加入250μL淬灭缓冲液。涡旋20秒，磁分离并吸弃上清。

12. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。室温孵育30?60分钟。磁分离并吸弃上清。

13. 向羧基磁珠加入250μL淬灭缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。

14. 从磁力架上取下EP管。添加100μL存储缓冲液。涡旋混合并在2?8°C储存偶联好的磁珠。

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