GST融合蛋白分离磁珠硅基GSH磁珠GST蛋白纯化磁珠GST磁珠|价格|厂家|多少钱-全球塑胶网-移动端

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BK2021081112	CAS	BK2021081112			100		0

1.产品描述

1.1 产品用途

谷胱甘肽修饰磁珠 Si-GSH 非常适合用于小型规模的GST标签融合蛋白质纯化。

1.2 原理

把含有GST标签的融合蛋白添加到 Si-GSH磁珠中，在经过短暂的孵育后，重组蛋白将被吸附到磁珠上，然后可使用磁珠分离架把GST融合蛋白洗脱下来。磁分离技术消除了微管的变化、最大限度地减少样品的损失和消除繁杂传统离心方法的步骤，而且适合于自动化操作。

1.3 材料的描述

Si-GSH磁珠是由还原型谷胱甘肽共价结合在的400nm的超顺磁性微球表面组成，表面二氧化硅层可最大限度降低非特异性蛋白的吸附。磁珠储存在含有20%乙醇的PBS（PH=7.4）中，每1mg磁珠能够吸附超过40ug以上的GST标签融合蛋白。

1.4 产品保存

产品能够2-8℃稳定存储，避免冷冻。在存储和所有操作中保证磁珠浸没液体中，干燥的环境会导致吸附量的下降或丧失。使用前应充分悬浮磁珠，避免细菌和真菌污染。

2.操作流程

该说明书以100 μl的 Si-GSH磁珠为例，您可根据需要进行放大或者缩小。

2.1 细胞破碎液和缓冲液准备

从大肠杆菌细胞中制备含有GST标签的重组蛋白，可采用高压匀浆或超声破碎等方法。

过程所需缓冲液：（1）上样Buffer/洗杂Buffer: 1x PBS pH=7.4 （2）洗脱Buffer: 10mM GSH（还原型谷胱甘肽）, 50mM Tris，pH 8.0

2.2 使用前准备

1）充分摇匀磁珠。

2）取100μl磁珠到一个干净的管中。

3）把管放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。

4）加入1ml 洗杂/上样Buffer充分混匀后，放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。重复该次步骤2次。

2.3 融合蛋白结合

1) 用100μl的上样Buffer/洗杂Buffer重新悬浮磁珠。

2) 加入含有GST标签重组蛋白的样品轻轻混匀。

3) 放置在振荡器或摇床中在室温下孵育30-60min（如果重组蛋白在室温下不稳定，可以再4℃进行）。

4) 把孵育后的小管放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。如果有需要可保留上清，另作检测。

5) 加入1ml 洗杂/上样Buffer充分混匀后，放在磁力架上收集磁珠，去上清。重复该次步骤至少3次。

2.4 目的蛋白洗脱

1) 加入100μl洗脱Buffer重新悬浮磁珠，放置在振荡器上室温震荡5min

2) 使用磁力架收集磁珠，把上清转移到另一个干净的管中。

3) 重复步骤1和步骤2.

3.问题解决方法

问题	可能原因	解决方案
GST融合蛋白产量低或无目的蛋白	融合蛋白是以包涵体表达	降低培养温度，把IPTG的浓度减少到10mM，或者适当减少诱导时间；将表达的包涵体进行适当的变性和重新折叠。
	使用的磁珠太少	增加磁珠使用量。
	上样样品太少	增加上样样品量。
	融合蛋白没有活性	使用更加温和的破碎方法，如加入溶菌酶破碎细胞，防止目的蛋白变性。
	融合蛋白降解	在细胞破碎液和洗杂Buffer中加入适量的PMSF。
	融合蛋白不能有效的洗脱下来	增加洗脱时间或者增加洗脱液的浓度到15mM或更高浓度的谷胱甘肽；调节洗脱液的PH到8.0-9.0；在洗脱Buffer加入Triton X-100（终浓度0.1%）、Noctylglucoside（终浓度2%）或者NaCl（终浓度0.1-0.2M）。
洗脱液中有多个条带.	融合蛋白被分解	再细胞破碎液和洗杂Buffer中加入适量的PMSF。
	一些马的蛋白，如分子伴侣会与GST融合蛋白结合	在洗杂Buffer中加入5mM的DTT。将含有目的蛋白破碎液置于chaperonin Buffer（2MmATP，10mM MgSO4，50mM Tris-HCl）37℃孵育10min，再进行纯化。
	超声破碎可能会导致一些蛋白和融合蛋白结合	使用更加温和的破碎条件或者更换破碎方法。
	一些蛋白会非特异性结合到融合蛋白或者填料上	优化洗杂条件，加入1% TritonX-100,1% Tween-20,1% CTAB,10mM DTT，0.03% SDS或0.1% NP-40。这些试剂能够帮助去除一些非特异性吸附。

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