一、概述

GST融合蛋白纯化磁珠（Magarose-GSH）具有高效、快速、方便等特点，是公司针对纯化 GST 标签融合蛋白而研制的一种新型纯化介质，可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步获得高纯度的目标蛋白，极大地简化纯化工艺和提高纯化效率，适合科研和工业领域便捷地进行 GST 融合蛋白的纯化。使用Magarose-GSH磁珠进行 GST Pull-down 实验，操作简单、快捷，具有传统方法无可比拟的优势。

二、产品特性

产品名称	Magarose-GSH
货号	PMAG002
磁珠浓度	25%（v/v）in 20%乙醇
配基及密度	20-30 umol GSH/ml磁珠
介质	6%交联磁性琼脂糖
粒径	20-45μm
配体结合	6-10 mg GST融合蛋白/ml磁珠
保存	2~8℃保存一年

三、使用方法

1.GST标签蛋白纯化

结合/洗杂液：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.4；

洗脱液：50 mM Tris-HCl，50 mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0； 洗脱液配制方法：0.1 M Tris 溶液 50 mL，1.535 g还原型谷胱甘肽，然后用 0.1 M 盐酸调 pH到 8.0，加去离子水至 100 mL。

磁珠使用量由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得，这里仅以获得 5-10 mg 目标蛋白为例：

1.1磁珠准备：将GST纯化磁珠充分混匀，使用移液器取4 ml的磁珠悬浮液（磁珠体积为1 ml）置于离心管中，将离心管置于磁分离器上，待溶液澄清后，用移弃清液，加入去离子水反复清洗去除酒精。

1.2磁珠平衡：加入与悬浮液等体积的结合/洗杂液，用枪头反复吹打5次，将离心管置于磁分离器上，待溶液澄清后，移弃清液，重复洗2次。

1.3磁珠与蛋白结合：将GST融合蛋白裂解液加入到处理好的磁珠中，颠倒混匀，室温孵育30 min（如果目标蛋白不稳定，建议置于2-8 ℃下孵育1 h）。

1.4磁珠洗杂：置离心管于磁分离器，待溶液变澄清后，移上清液至新离心管，保留以备检测。向离心管中加入2倍悬浮液体积的结合/洗杂液，使用枪头反复吹打5次，置离心管于磁分离器，待溶液澄清，移上清液至新离心管，保留以备检测。重复洗杂步骤2次。

1.5洗脱：加入与悬浮液等体积的洗脱液，用移液器吹打5次，室温下孵育5-10 min，置于磁分离器上，待溶液澄清后，吸取上清液，即为目的蛋白组分。重复上述步骤多次，分别收集洗脱组分并留样检测，以提高目的蛋白的回收量。

1.6SDS-PAGE检测：将纯化所得样品用SDS-PAGE 检测。

注意：1. 谷胱甘肽现用现配。

2. 不同的 GST 融合蛋白与磁珠结合强弱程度不同，对大部分 GST 融合蛋白，使用含10mM 还原性谷胱甘肽的洗脱液即可洗脱目标蛋白；对少数结合能力较强的GST融合蛋白，可适当延长洗脱时间，增加洗脱次数，或提高洗脱液中还原型谷胱甘肽的浓度；

3. 结合/洗杂液和洗脱液中可添加1~5mM EDTA、1~10mM DTT、0.1~1.0%Triton X-100、0.1~1.0%Tween 20等。

1.7 磁珠清洗和保存：磁珠使用后经过简单清洗处理后，可以继续用于后续的纯化操作，也可长时间保存。用户可根据磁珠使用情况选择清洗方法，主要有：

情况1：重复使用次数较少，结合能力下降不明显时，可采用高pH和低pH Buffer交替洗涤的方式进行清洗：

w 高pH洗（碱洗）：使用后的磁珠加入10 mL 清洗液A（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液；

w 低pH洗（酸洗）：加入10 mL 清洗液B（0.1 M 醋酸钠，0.5 M NaCl，pH 4.5），漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液；

w 重复碱洗、酸洗交替清洗2次，共3次。

情况2：重复使用次数较多时，由于沉淀、变性或非特异性吸附蛋白积累，导致磁珠结合目标蛋白的能力明显下降。去除沉淀或变性蛋白，可按下面的方法进行洗涤：

w 先用5 mL 6 M盐酸胍洗涤2次，每次漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液；

w 再用10 mL 1X PBS洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，磁性分离，去除上清液。

情况3：去除疏水性结合物质，可按下面方法进行洗涤：

w 先用5 mL 70%乙醇或0.1%的非离子型表面活性剂洗3次，每次漩涡60 s，磁分离，去除上清液；

w 再用10 mL 1X PBS洗涤3次，每次漩涡振荡60 s，磁分离，去除上清液。

注意：完成情况1或2的清洗后，如用户需继续使用磁珠纯化蛋白，需先用结合/洗杂液洗2~3次。如不需继续使用，则用20%乙醇洗磁珠2~3次后，再加入20%（v/v）乙醇到磁珠中使总体积为4 mL，保存于2~8°C。

2．Pull-Down操作流程

结合/洗杂Buffer：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH7.4

洗脱Buffer：50 mM Tris-HCl, 10 mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.0

1）磁珠准备：取适量GST纯化磁珠（磁珠体积为总体积的10%），将磁珠反复颠倒，充分混匀，使用移液器取适量的磁珠悬浮液，置于离心管中，将离心管置于磁分离器，待溶液澄清后，吸弃清液。

2) 磁珠平衡：从磁分离器上取下离心管，加入与悬浮液等体积的结合液，反复吹打5-10次，置离心管于磁分离器上，待溶液澄清后，吸弃清液，重复洗涤2次。

3) 磁珠结合靶蛋白：将含GST 标签的靶蛋白样品加入到处理好的磁珠中，颠倒混匀。将离心管置于混合仪上，室温孵育30 min。

4) 磁珠洗杂：将离心管置于磁分离器，待溶液澄清后，移出上清液，保留以备取样检测。向离心管中加入2倍悬浮液体积的洗杂液，反复吹打5-10次，置离心管于磁分离器上，待溶液变澄清后，吸弃上清液，重复上述步骤2次，即得靶蛋白-磁珠复合物。

5) 目标蛋白与靶蛋白-磁珠复合物的结合：将含有目标蛋白样品加入到处理好的靶蛋白-磁珠复合物中，颠倒混匀。将离心管置于混合仪上，室温孵育30 min。

6) 磁珠洗杂：将离心管置于磁分离器，待溶液澄清后，移出上清液，保留以备取样检测。向离心管中加入2倍悬浮液体积的洗杂液，反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，吸弃上清液。重复上述步骤2次。目标蛋白通过与靶蛋白的结合，从混合体系中被捕获。

7) 目的蛋白的洗脱：在上述离心管中加入与悬浮液等体积的洗脱液，用移液器吹打5次， 然后在室温下置于翻转混合仪或者手动轻轻翻转离心管，5-10 min后，置于磁分离器上，待溶液变澄清后，吸取上清液，收集洗脱组分，即得到靶蛋白和目标蛋白复合物。也可以再重复操作一次，分别收集洗脱组分，留待检测。

3．注意事项

1) 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；

2) 使用本产品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；

3) 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；

4) 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；

5) 本产品可重复使用，重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；

6) 本产品需与磁性分离器配套使用；

本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。

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