一、概述

Homo-Epoxy磁珠提供永久结合和固定各种含胺基、巯基配体。 珠子表面上的高密度环氧酸基团（Epoxy）可用于配体如蛋白质、肽和核酸的共价偶联。 环氧基磁珠可用于共价偶联胺、巯基或含羟基的配体。含羟基、胺和巯基的配体的偶联分别在pH 11-13、pH 9和pH 7.5~8.5下反应。不溶于水的配体可在50％有机溶剂（二甲基甲酰胺）中偶联。 Homo-Epoxy包含短臂和长臂磁珠，都适用于蛋白质和多肽的偶联。。

二、产品特性

1. HomoS-Epxoy短链羧基磁珠

基团密度 400 umoles Epoxy/g beads

2. HomoL-Epoxy长链羧基磁珠

基团密度 200 μmoles Epoxy/g beads

形态：超顺磁球形

直径：1μm

储存：10 mg/mL ，去离子水中 2~8 °C保存，勿冻结。

常温运输，正确使用保存期一年。

三、偶联方案

环氧基磁珠 Homo-Epoxy有利于小配体与磁珠的结合，包括但不限于单糖、肽和二糖。 它也可用于偶联各种配体，如蛋白A、StrepTactin、枯草杆菌蛋白酶和免疫球蛋白。 如果配体负载量太低，可能会导致非特异性吸附过大；如果配体负载量过高，可能会造成空间位阻。因此，强烈建议优化每个单独应用的磁珠用量。推荐用量一般为0.04~0.4 mg多肽/ mg磁珠。 以下实验方案可相应放大和缩小。

A.缓冲液

1) 偶联缓冲液（Coupling Buffer）: 0.1 M sodium carbonate buffer or 0.1 M sodium phosphate, pH 8.5-10;

注意：缓冲液的离子强度对于获得更高的偶联效率至关重要。 偶联缓冲液应具有最小的离子强度，并且不应含有任何氨基（例如Tris）、硫醇、羟基和酚。但洗涤或储存缓冲液可含有氨基、硫醇、羟基和酚基团。

2) 封闭缓冲液（Blocking Buffer）: 1 M ethanolamine， pH 9.0;

3) 洗涤缓冲液（Wash buffer）: PBS, pH 7.4.;

B.偶联方法

注意：将环氧基磁珠按10mg/ml悬浮在50％丙酮中，剧烈涡旋分散磁珠并储存在4 ℃。使用前混匀磁珠。

1. 将10mg磁珠转移至EP管中。

2. 将EP管置于磁磁力架上1min，吸弃上清液，用1ml偶联缓冲液重新悬浮磁珠。

3. 重复步骤2三次。

注意：一旦水化，应尽快使用磁珠。

4. 将适量的蛋白质或肽溶解在1ml偶联缓冲液中。

注意：环氧基活化磁珠的偶联效率因配体而异。用户应根据经验优化配体的浓度。推荐1-10 mg/ml用于蛋白质结合；对于小肽，配体浓度应超过200 umol/ml。

5. 将蛋白质溶液加入洗过的磁珠中，重悬磁珠并孵育。

注意：胺类配体如蛋白质在25 ℃下偶联15~48 h。但是，如果配体对温度非常敏感，可在4℃下偶联至少48~72 h。肽、含羟基的配体例如碳水化合物或含巯基的配体在25~75 ℃下偶联4~15 h。

6. 用1ml PBS缓冲液洗磁珠3次。

7. 将0.5~1ml封闭缓冲液添加至磁珠中，并在4℃下孵育至少4h或过夜。

8. 用1ml PBS缓冲液洗磁珠4-6次。

9. 用PBS缓冲液（0.1％叠氮化物）将磁珠重悬至所需浓度，储存于2~8 ℃并避免冻结。

C.偶联效率的优化

C-1．配体用量优化

在特定配体浓度以下，缓冲液中配体的量与环氧基磁珠的偶联量成正比；当配体浓度达到一定浓度后，配体偶联效率通常会逐渐减小。通常1~10 mg配体/ g磁珠是研究最佳配体浓度的范围。

C-2．偶联用缓冲液与pH值

为了有效控制pH值，建议使用10 mM的最小缓冲液强度。 合适的缓冲液包括碳酸盐、硼酸盐和磷酸盐；不要使用包含Tris、甘氨酸或其他亲核试剂等组成的缓冲液。 环氧基磁珠在pH 9?13下较易与配体偶联，偶联pH的选择通常受到配体在碱性缓冲液中稳定性的限制。环氧基团在较高pH下与配体反应更快，然而高的pH同样促进了环氧基团的竞争性水解反应。偶联含羟基的配体大约pH?13。

C-3．偶联温度和时间

大多数应用推荐在?20°C过夜偶联配体。 若在选定温度下配体稳定，则可在较高温度下进行偶联，最高可达40°C，通常反应更快。 若偶联缓冲液pH和反应温度都高，则偶联时间需缩短。应避免延长偶联反应时间可能导致的配体降解。

C-4．剩余活性基团的封闭与洗涤

偶联后残留在磁珠上的活性基团需被封闭以避免与感兴趣的蛋白质发生不希望的反应。 使用1M乙醇胺在pH 8-9进行封闭反应4h。封闭完成后需要使用偶联缓冲液彻底洗涤磁珠以除去过量配体。对通过离子相互作用被捕获在树脂上少量配体，建议交替使用酸性缓冲液（100mM乙酸盐，500mM NaCl，pH4.0）和碱性缓冲液（100mM磷酸盐，500mM NaCl，pH8.0）洗涤。

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