一、概述

羧基磁珠（G-COOH）是采用亲水的高分子材料GMA与超顺磁性材料复合形成的一种新型功能化磁性纳米颗粒，提供永久结合和固定各种胺基配体。与传统磁珠相比，G-COOH磁珠具有超顺磁性、更快的磁响应性同时保持微球良好的分散性、极低的非特异性吸附和更高的表面羧基密度等特性，能便捷高效地与多种生物配体（蛋白、多肽、寡聚核苷酸、药物分子等）进行高载量共价偶联，具有非常高的目标物质结合能力，是医学与分子生物学研究中重要的载体工具。用EDC活化磁珠表面的羧基，使配体通过伯胺基与羧基磁珠偶联，可形成稳定的酰胺键。 G-COOH磁性纳米颗粒，适用于各种磁性分离应用，包括亲和力富集、蛋白质纯化、免疫沉淀和细胞分选。

二、产品特性

1. 短链羧基磁珠GS-COOH

基团密度 600 umoles carboxylic acid/g beads

2. 长链羧基磁珠GL-COOH

羧基密度 300 μmoles carboxylic acid/g beads

形态：超顺磁球形

直径：200nm

储存：10 mg/mL ，去离子水中2~8 °C保存，勿冻结。

常温运输，正确使用保存期一年。

三、缓冲液

Coupling Buffer（偶联缓冲液）:

50 mM MES [2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid], pH 6.0, 0.01% Triton X-100;

Coupling Agent（偶联试剂）:

EDC [1-ethyl-3-(3-dimethyaminopropyl)-carbodiimide]；

Sulfo-NHS [N-hydroxysulfosuccinimide] (Optional)

Quench Buffer（淬灭缓冲液）:

TBS (25 mM Tris-Cl, 130 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 8, 0.01% Triton X-100;

Storage Buffer（储存缓冲液）:

TBS or PBS containing 0.01% Triton X-100 or 0.01% Tween 20. Add preservative if needed.

四、 G-COOH的使用

以下方案为配体与100μL的 G-COOH羧基磁珠的偶联方案。该方案可按需放大或缩小。强烈建议对珠子活化（EDC、EDC / NHS和pH）和偶联条件（配体浓度、偶联缓冲液、pH、反应体积和温育时间）进行优化。

注意：

■ 通过涡旋确保羧基磁珠均匀悬浮。

■ 为获得最佳性能，在无胺偶联缓冲液中偶联，蛋白应为0.5?4mg / mL，寡核苷酸为20?100μM，不含其它蛋白。较高浓度的蛋白可灵活地优化反应体积。含tris、甘氨酸、醋酸盐或柠檬酸盐的缓冲液不能使用。

■ 含有0.01％的Triton X-100的50 mM MES缓冲液（pH 6.0）可用作活化和偶联缓冲液。当使用化学合成的寡核苷酸时，寡核苷酸末端应有5'-胺基以偶联羧基磁珠。

■ 珠子含有0.5％SDS以稳定悬浮液。尽管非必须，但在所有缓冲液中包含0.01?0.05％Triton X-100或0.01?0.05％吐温20将防止羧基磁珠凝结并改善分散特性。

偶联方案A：使用EDC的两步偶联

该方案被推荐用于将蛋白偶联到羧基磁珠上。首先使用水溶性碳二亚胺（EDC）活化珠上的羧基以形成胺反应性中间体。除去EDC后，加入蛋白质配体并通过蛋白质上的伯胺与磁珠的活化羧基偶联。

1. 确保蛋白或配体在无胺偶联缓冲液中。100μL偶联缓冲液中需50?400μg蛋白用于耦合。放在冰上。

2. 涡旋振荡重悬 G-COOH羧基磁珠。吸取100μL磁珠到1.5mL EP管中，磁分离并吸弃上清。

3. 加入200μL偶联缓冲液，涡旋20秒洗涤磁珠，磁分离并吸弃上清。

4. 按步骤3再次清洗羧基磁珠两次。

5. 使用前用偶联缓冲液中配制EDC（50 mg / mL）。

6. 向磁珠中加入80μL偶联缓冲液和20μL新配的EDC溶液，混匀。室温孵育15分钟，磁分离并吸弃上清。

7. 用200μL偶联缓冲液清洗磁珠，涡旋混匀，磁分离并吸弃上清。

注意：该步骤应该快速进行，因为磁珠上的胺反应性中间体不稳定。

8. 向羧基磁珠加入100μL偶联缓冲液和50?400μg蛋白质或配体，涡旋混匀。

9. 室温下孵育30分钟。根据配体和浓度的不同，最佳孵育时间可能为0.5?4小时。

10. 将试管放入磁力架中，磁分离并吸弃上清。该上清液含有未结合的配体，如果优化方案可保存用于分析。

11. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。涡旋20秒，磁分离并吸弃上清。

12. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。室温孵育30?60分钟。磁分离并吸弃上清。

13. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。按该步骤再洗两次磁珠。

14. 从磁力架上取下EP管。添加100μL存储缓冲液。涡旋混合并在2?8°C储存偶联好的磁珠。

偶联方案B：用sulfo-NHS替代两步偶联

该方案与上述方案类似，但使用NHS。可通过加入稳定胺反应性中间体的sulfo-NHS来增加EDC介导的反应的效率。

1. 确保蛋白或配体在无胺偶联缓冲液中。100μL偶联缓冲液中需50?400μg蛋白用于耦合。放在冰上。

2. 涡旋振荡重悬 G-COOH羧基磁珠。吸取100μL磁珠到1.5mL的EP管中，磁分离并吸弃上清。

3. 加入200μL偶联缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。

4. 按步骤3再清洗羧基磁珠两次。

5. 使用前用偶联缓冲液中配制EDC（50 mg / mL）。在使用前用偶联缓冲液配制Sulfo-NHS（50mg / mL）。

6. 向磁珠中加入60μL偶联缓冲液、20μL新配的EDC溶液和20μL新配的Sulfo-NHS溶液。涡旋混匀。

7. 室温下混匀孵育15分钟。磁分离并吸弃上清。

8. 用200μL偶联缓冲液清洗磁珠。涡旋混匀，磁分离并吸弃上清。

9. 加入100μL偶联缓冲液和50?400μg蛋白或配体。涡旋混匀。在室温下连续混合孵育0.5?4小时。

10. 将试管放入磁力架中，磁分离并吸弃上清。该上清液含未结合的配体，如果优化方案可保存用于分析。

11. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。涡旋20秒，磁分离并吸弃上清。

12. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。室温孵育30?60分钟。磁分离并吸弃上清。

13. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。按该步骤再洗两次磁珠。

14. 从磁力架上取下EP管。添加100μL存储缓冲液。涡旋混合并在2?8°C储存偶联好的磁珠。

偶联方案C：一步偶联

这是一个快速结合方案，在一个反应中同时加入羧基磁珠、EDC和配体。该方案最适合偶联寡核苷酸和小分子，当配体上的羧酸基团的激活不会影响后续实验时。

1. 确保蛋白或配体在无胺偶联缓冲液中。100μL偶联缓冲液中需50?400μg蛋白或1?5nmol寡核苷酸进行偶联。放在冰上。

2. 涡旋振荡重悬 G-COOH羧基磁珠。吸取100μL磁珠到1.5mL的EP管中，磁分离并吸弃上清。

3. 加入200μL偶联缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。

4. 按步骤3再清洗羧基磁珠两次。

5. 从磁力架上取下EP管。在80μL偶联缓冲液中加入50?400μg配体。

6. 在室温下孵育30分钟。

7. 使用前用偶联缓冲液配制EDC（50 mg / mL）。

8. 将20μL新配的EDC溶液加入磁珠中。涡旋混匀，室温下连续混合孵育0.5?4小时。

9. 将试管放入磁力架中，磁分离并吸弃上清。该上清含未结合的配体，如果优化方案可以保存用于分析。

10. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。涡旋20秒，磁分离并吸弃上清。

11. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。室温孵育30?60分钟。磁分离并吸弃上清。

12. 向羧基磁珠加入500μL淬灭缓冲液。剧烈漩涡20秒，磁分离并吸弃上清。按该步骤再洗两次磁珠。

13. 从磁力架上取下EP管。添加100μL存储缓冲液。涡旋混合并在2?8°C储存偶联好的磁珠。

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