在特定的缓冲液条件下，生物分子表面会带有正/负电荷，与离子交换层析介质上偶联的配基（一般为带电荷基团）之间会发生吸附/排斥作用。发生排斥作用的生物分子不与离子交换层析介质结合，直接随着流动相流出柱子，发生吸附作用的生物分子则被吸附在离子交换层析介质上，等到未发生吸附的生物分子被流动相冲洗干净后，逐步改变流动相条件（一般是盐浓度或pH），将吸附在离子交换层析介质上的生物分子按照吸附力强弱不同分别洗脱下来。