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NAD激酶(NADK)生化检测测定

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上海优选生物科技有限公司
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NAD激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NADKEC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,可催化NAD(H)ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成 NADP(H)。因此,NAD激酶在合成 NADP(H)

以及调节NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。

测定原理:

NADK 催化NAD+磷酸化,生成NADP+NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPHNADPH 通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT),通过在600 nm下测定MTT的还原速度(吸光值的变化)可反映出NADK活性的大小。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 25 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存;

试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至600nm,蒸馏水调零。

2、将试剂一和试剂二 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min 以上。

3、工作液Ⅰ的配制:在试剂三中加入8mL试剂一,充分混匀待用;现配现用;

工作液Ⅱ的配制:在试剂四中加入11mL试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂4℃保存一周;

工作液Ⅲ的配制:在试剂五中加入11mL试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂4℃保存一周;

4、加样表

试剂名称(μL)

测定孔

样本

20

工作液Ⅰ

80

充分混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min,立即煮沸2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g25℃离心 10min,取上清

上清液

25

工作液Ⅱ

110

工作液Ⅲ

110

加完试剂混匀后立即在600n下测定30秒的吸光值A13分钟30 秒时的吸光值A2,计算△A= A2-A1

NADK 活性计算:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.002463x +0.004x NADP标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。

1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADKnmol/min/mg prot=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(V1×Cpr)÷T

=135.3×(△A - 0.004)÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADKnmol/min/g 鲜重)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(W×V1÷V2)÷T

 =135.3×(△A - 0.004)÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADKnmol/min/104cell=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(500×V1÷V2)÷T

=0.271×(△A -0.004

V1:加入反应体系中样本体积,0.02mLV2:加入提取液体积,1mLT:反应时间,3min

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

b.96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.001232x +0.004x NADP标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。

1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADKnmol/min/mg prot=[812×(△A - 0.004)×V1]÷(V1×Cpr)÷T

=270.6×(△A - 0.004)÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADKnmol/min/g 鲜重)=[812×(△A - 0.004)×V1]÷(W×V1÷V2)÷T

 =270.6×(△A - 0.004)÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADKnmol/min/104cell=[812×(△A - 0.004)×V1]÷(500×V1÷V2)÷T

 =0.542×(△A -0.004

V1:加入反应体系中样本体积,0.02mLV2:加入提取液体积,1mLT:反应时间,3min

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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