二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶, 既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的大小直接影响着光合速率。
测定原理:
在Rubisco 的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶 I(NADH)氧化。因此,340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率,还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:25mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入700uL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂
4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入700uL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂
4℃保存一周;
粗酶液制备 :
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:临用前在试剂二中加入22.5mL试剂一,充分混匀,在37℃(哺乳动物) 或 25℃(其它物种)孵育 5min;现配现用;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入6uL样本、7uL试剂三、7uL试剂四和180uL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时吸光值A1和2min20s时的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。
Rubisco 活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃中1mg蛋白1min氧化1nmol NADH。
Rubisco 活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=2680×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义:25℃中1g组织1min氧化1nmol NADH。
Rubisco 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)
÷T=2680×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义: V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.006 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;
b.使用96孔板测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃中1mg蛋白1min氧化1nmol NADH。
Rubisco 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=5360×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义:25℃中1g组织1min氧化1nmol NADH。
Rubisco 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)
÷T=5360×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义:
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.006mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;