植物叶绿体中果糖1,6-二磷酸醛缩酶
(Fructose 1,6 bisphosphate aldolase,FDA)试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
产品内容:
提取液一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
提取液二:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体25mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解。
试剂五:液体×1瓶,4℃避光保存。
产品说明:
植物叶绿体中果糖1,6-二磷酸醛缩酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。催化果糖1,6-二磷酸和景天庚酮糖1,7-二磷酸的合成反应,在各种逆境胁迫下表现不同的响应。
果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙酮生成NAD和α-磷酸甘油,340nm处吸光值的变化可反映果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。
自备仪器和用品:
天平、低温离心机、震荡仪、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
操作步骤:
一、酶液提取
按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于4℃,1000g离心5min,取上清在4℃,4500g离心20min,去上清,取沉淀加0.5mL提取液二,置于震荡仪上震荡30s溶解,置冰上30min,重复操作一次(或者震荡溶解后超声,超声条件为功率200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,12000g离心10min,取上清待测。
二、测定操作
1. 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 取1mL石英比色皿,依次加入500μL试剂一,100μL试剂二,100μL试剂三,100μL试剂四,100μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,△A=A2-A1
三、计算公式:
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /g)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T= 321.54×ΔA÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活单位定义:每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T = 321.54×ΔA÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FDA(nmol/min /mL)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA
V反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
注意事项:
配置好的试剂二、试剂三、试剂四3天内使用完。