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植酸酶（phytase）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植酸酶（phytase）是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶，它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷，降低粪便中的磷含量，减轻对环境的污染，改善营养成分的吸收和利用，因此具有极其广泛的研究和应用价值。
测定原理
植酸酶在一定温度和pH值条件下，水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物，无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物，在700nm处有特征吸收峰，根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅，超声溶解器，回旋式振荡器。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
缓冲液：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×2 支，4℃保存， 临用前加缓冲液 4mL 配制，现用现配。
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
显色剂：粉剂×6 瓶，4℃保存，临用前根据用量每瓶加0.4mL双蒸水溶解，再加1.6mL试剂三混匀。
样本处理
1. 酶制剂：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：500~1000的比例（建议称取约0.001g，加入1mL提取液）加入提取液，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，待测。
2. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡15min，4℃，4000g 离心10min，取上清待测。
3. 饲料样品：饲料烘干粉碎，过40目筛，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，在超声波溶解器上溶解15min，再用回旋式振荡器振荡 15min，4℃，4000g 离心10min，取上清待测。
4. 培养液等液体样品，混匀直接测定。
测定操作表
对照管 |
测定管 |
|
样本（μL） |
20 |
20 |
37℃温育 5min |
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试剂一（μL） |
80 |
|
试剂二（μL） |
100 |
|
37℃温育 30min |
||
试剂一（μL） |
80 |
|
试剂二（μL） |
100 |
|
显色剂（μL） |
100 |
100 |
室温静置10min，4000g，4℃，离心10min，取上清200μL，缓冲液调零测定700nm 处吸光值，△A=A测定管-A对照管 |
||
酶活性计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线y=0.1084x+0.0236，R2=0.9998
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每毫克蛋白每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0236）÷0.1084×V反总÷（V样×Cpr）÷T×N= 4.613×（△A-0.0236）÷Cpr×N
2．按照样本质量计算
酶活性定义：在37℃，pH5.5的条件下，每克样本每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/g）=（△A-0.0236）÷0.1084×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T×N= 4.613×（△A-0.0236）÷W×N
3. 培养液等液体样品
酶活性定义： 在37℃，pH5.5的条件下，每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/mL）=（△A-0.0236）÷0.1084×V 反总÷V 样÷T×N
= 4.613×（△A-0.0236）×N
V 反总：反应总体积，0.3mL；V 样：反应体系中加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；N：样品稀释倍数
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0542x+0.0236，R2=0.9998
2． 按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 37℃，pH5.5的条件下，每毫克蛋白每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0236）÷0.0542×V反总÷（V样×Cpr）÷T×N= 9.226×（△A-0.0236）÷Cpr×N
2．按照样本质量计算
酶活性定义： 在37℃，pH5.5的条件下，每克样本每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/g）=（△A-0.0236）÷0.0542×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T×N= 9.226×（△A-0.0236）÷W×N
3. 培养液等液体样品
酶活性定义： 在37℃，pH5.5的条件下，每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位。
植酸酶活性（μmol/min/mL）=（△A-0.0236）÷0.0542×V反总÷V样÷T×N
= 9.226×（△A-0.0236）×N
V 反总：反应总体积，0.3mL；V 样：反应体系中加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；N：样品稀释倍数
注意事项
1. 试剂三 4℃保存一个月，显色剂需要临用前根据用量配制，每一瓶是20个样本的用量，新配制的显色剂若有颜色则已经污染或者试剂过期，应放弃使用。
2. 测定前先做预实验，将待测样本的浓度调整到合适的范围，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 对照管与测定管加入试剂一和试剂二的顺序是相反的，务必保证加入试剂时间的一致性，以保证反应的准确性。
