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漆酶（Laccase）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解
以及生物检测方面有非常广泛的应用。
测定原理
漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
工作液：粉剂×2 瓶，4℃避光保存，临用前加7.5mL试剂一溶解。
酶液提取
1． 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2． 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后 4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3． 细胞培养液：直接检测。
测定操作表
对照管 |
测定管 |
|
样本（μL） |
25 |
|
煮沸样本（μL） |
25 |
|
工作液（μL） |
150 |
150 |
60℃，3min，于微量石英比色皿/96 孔板中测定 420nm 处吸光值 A，△A=A测定管-A 对照管 |
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酶活性计算公式
a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 65×△ A÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min /g）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 65×△ A÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min/104cell）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T
= 65×△ A÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min /L）=△A÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 65000×△ A
ε：ABTS 毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.175mL；V 样：反应中样本体积，0.025mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min
b.用96孔板测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 130×△A÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min/g）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 130×△ A÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min/104cell）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T
= 130×△A÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。
漆酶活性（nmol/min/L）=△A÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 1.3×105×△A
ε：ABTS 毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，0.175mL；V 样：反应中样本体积，0.025mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min
注意事项
1. 工作液需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。
2. 测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在
计算公式中乘以稀释倍数。
