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H2S含量测定试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
H2S是一种新型气态信号分子，存在于脑内的神经递质，生理浓度的 H2S对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用，并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。
测定原理：
H2S与醋酸锌、N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝，亚甲基蓝在665nm处有最大吸收峰，通过测定其吸光值可计算 H2S含量。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：液体 1.5mL×1 管，4℃避光保存。
样品处理：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清（浆）：直接测定。
操作表：
1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至665nm。
2、 操作表
空白管 |
测定管 |
|
样品（μL） |
75 |
|
H2O（μL） |
75 |
|
试剂一（μL） |
75 |
75 |
充分震荡混匀 |
||
试剂二（μL） |
75 |
75 |
10000g，4℃，离心 10min，去上清，留沉淀 |
||
H2O（μL） |
150 |
150 |
10000g，4℃，离心 10min，去上清，留沉淀 |
||
试剂一（μL） |
75 |
75 |
试剂三（μL） |
75 |
75 |
充分震荡混匀 |
||
试剂四（μL） |
75 |
75 |
12000rpm，4℃，离心 10min，取上清 |
||
试剂五（μL） |
15 |
15 |
混匀，25℃静置20min，于微量石英比色皿/96孔板中，空白管调零，测定665nm吸光值，记为 A665。
H2S含量计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为：y=0.0044x，R2=0.9988
（1）组织样品
a.按照蛋白浓度计算
H2S（μmol/mg prot）=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3 =0.727×A665 ÷Cpr
b.按照样本重量计算
H2S（μmol/g）=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10-3 = 0.727×A665 ÷W
(3) 细胞
H2S（μmol/104 cell）=A665÷0.0044×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量(万个)）×10 -3
=0.727×A 665 ÷细胞数量（万个）
（2）液体样品 H2S（μmol/L）=A665÷0.0044×V 反总÷V 样= 727×A665
V 反总：反应总体积，0.24mL；V 样：反应中样品体积，0.075mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为：y=0.0022x，R2=0.9988
（1）组织样品
a.按照蛋白浓度计算
H2S（μmol/mg prot）=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3 =1.454 ×A665 ÷Cpr
b.按照样本重量计算
H2S（μmol/g）=A665÷0.0044×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10-3 = 1.454×A665 ÷W
(3) 细胞
H2S（μmol/104cell ）=A665÷0.0044×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量(万个)）×10-3
=1.454×A665 ÷细胞数量（万个）
（2）液体样品 H2S（μmol/L）=A665÷0.0044×V 反总÷V 样= 1454×A665
V 反总：反应总体积，0.24mL；V 样：反应中样品体积，0.075mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL
注意事项
最低检出限为8μmol/L。
