组织总磷含量测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

磷的存在形态包括无机磷与有机磷。无机磷主要指磷酸根，参与生物体内多种代谢，包括能量代谢、核酸代谢、蛋白质磷酸化和脱磷酸化等。通过测定总磷与无机磷含量即可了解作物对磷的利用率，进而为合理施肥提供依据。

测定原理：

总磷经消化后，转化成无机磷。钼蓝法是测定无机磷含量的经典方法，一定条件下，钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质，通过测定660nm光吸收，即可计算无机磷含量，进而可计算出组织中总磷含量。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、离心机、水浴锅、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿、蒸馏水和浓硫酸。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存） （强腐蚀性，强氧化性）。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前配制，加入15mL蒸馏水，溶解后再加入10mL

试剂二，混匀。

标准品：液体×1 支，20μmol/L 无机磷标准液，－20℃保存。

有机磷消化：

取带盖试管，进入精确称取的约0.1 g组织，加浓硫酸1.0 mL，盖紧（防止水分散失）后沸水浴10min左右，待溶液呈黑色或棕色时取出。稍冷后，加试剂一200μL，充分混匀，盖紧后继续沸水浴，直到溶液呈透明状，取出室温冷却后，加蒸馏水8.8mL，充分混匀；室温，8000g，离心10min，取上清液待测。

测定操作：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2. 打开水浴锅，调节温度到40℃。

3. 空白管：取EP管，依次加入500μL蒸馏水，500μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min后于660nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，依次加入50μL标准液，450μL蒸馏水，500μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min后于660nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 测定管：取EP 管，依次加入50μL上清液，450μL 蒸馏水，500μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min 后于660nm测定吸光度，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

 

 

组织总磷含量计算公式：

（1） 按照蛋白含量计算

总磷含量(mmol/mg prot) = [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷Cpr= 1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

（2） 按照样本质量计算

总磷含量(mmol/g )= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷W= 1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

C 标准液：1 mmol/L；V 总：上清液总体积，10 mL=0.01 L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

W：样品质量，g。

注意事项：

1. 试剂三需临用前配制，并且当天使用完毕。

2. 40min内完成比色。

3. 最低检出限为10μmol/L。