组织无机磷含量测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

无机磷主要指磷酸根，参与生物体内多种代谢，包括能量代谢、核酸代谢、蛋白质磷酸化和脱磷酸化等等，此外促进碳水化合物的合成、转化和转运。

测定原理：

钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质，通过测定660nm光吸收，即可计算无机磷含量。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前配制，加入20mL蒸馏水，充分溶解后加入试剂二（全部），混匀。

标准品：液体×1 支，2μmol/L无机磷标准液，4℃保存。

无机磷提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入 1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2. 打开水浴锅，调节温度到40℃。

3. 空白管：取EP管，依次加入500μL蒸馏水，500μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min后于660nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，依次加入50μL标准液，450μL蒸馏水，500μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min 后于660nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 测定管：取EP管，依次加入50μL上清液，450μL蒸馏水，500μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10 min后于660nm测定吸光度，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

组织无机磷含量计算公式：

（1） 按照蛋白含量计算

无机磷含量(mmol/mg prot)= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷Cpr=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

无机磷含量(mmol/g)= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷W=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

C 标准液：1mmol/L；V 总：上清液总体积，1mL=0.001L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

W：样品质量，g。

注意事项：

1. 试剂三需临用前配制，并且当天使用完毕。

2. 40min内完成比色。

3. 最低检出限为10μmol/L。