细胞色素b5（Cytochrome b5）含量测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与P450代谢活性密切相关。

测定原理：

氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰，通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、普通离心机， 超速离心机、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；

工作液配制：临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，加试剂二50mL充分溶解，4℃避光可保存1周。

样品中细胞色素b5提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体：100 000g，4℃离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g

离心30min，弃上清液。

4、待测液：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测

液需当天测定。

细胞色素b5含量测定操作：

1. 分光光度计预热 30min。

2. 工作液置于25℃水浴中预热30min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL 蒸馏水，1000μL工作液，室温静置2min，424nm 和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A空白管 1，490nm处吸光值记为A空白管 2。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL待测液，1000μL工作液，室温静置2min，424nm 和490nm 处吸光值，424nm处吸光值记为A测定管 1，490nm处吸光值记为A测定管2。△A 测定管= A 测定管 1- A 测定管 2。

注意：只需要做一个空白管。

 

样品细胞色素b5含量计算公式：

(1).按照蛋白浓度计算:

细胞色素b5含量(nmol/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）= 0.123×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2).按照样本质量计算:

细胞色素 b5 含量（nmol/g）= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W= 0.0614×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε：还原型细胞色素 b5 纳摩尔消光系数，171×10^-3 L/nmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V 反总：反应体系总体积，1.05 mL=0.00105L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，50μL=0.05 mL；V 样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量，g。