碱性木聚糖酶（Basic Xylanase，BAX）测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，BAX 一般分离自最适生长pH为9-11的微生物。

测定原理：

BAX 在碱性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算BAX 活力。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：

缓冲液：液体 65mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶提取：

1. 发酵液：发酵液于8000g，4℃，离心15min，取上清，作为待测样品。

2. 酶干粉：称约 0.1mg，加缓冲液1mL，震荡溶解待测。

测定操作表：

1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至540nm。

2、操作表

	对照管	测定管
样品（μL）	60	60
缓冲液（μL）	90	90
试剂一（μL）		60
试剂二（μL）	90
混匀，盖紧瓶盖，50℃水浴，反应 30min，立即沸水浴 10min 灭活。(注意不要让盖子爆开， 以免进水，改变了反应体系)
试剂一（μL）	60
试剂二（μL）		90
混匀，沸水浴显色 5min，取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，对照管调零，测定 A 540 。

 

 

 

BAX 计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=2.8432x-0.0293，R²=0.9985

1. 发酵液 BAX 活力计算

酶活定义：50℃，pH9.0条件下，每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/mL）=（A₅₄₀+0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀释倍数×1000

= 391×(A₅₄₀+0.0293 )

2. 酶干粉 BAX 活力计算

酶活定义：50℃，pH9.0条件下，每毫克酶每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/mg）=（A₅₄₀+0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀释倍数×1000 ÷W

= 391×(A₅₄₀+0.0293 )÷W

150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V 反总÷V 样=300μL÷60μL=5；1000：转化因子，即 1mmol/L=1000μ mol/L；W：样品质量：mg

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=1.4216x-0.0293，R²=0.9985

1. 发酵液 BAX 活力计算

酶活定义：50℃，pH9.0条件下，每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/mL）=（A₅₄₀+0.0293）÷1.4216÷150÷T×稀释倍数×1000

= 782×(A₅₄₀+0.0293 )

2. 酶干粉 BAX 活力计算

酶活定义：50℃，pH9.0 条件下，每毫克酶每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/mg）=（A₅₄₀+0.0293）÷1.4216÷150÷T×稀释倍数×1000 ÷W

= 782×(A₅₄₀+0.0293 )÷W

150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V 反总÷V 样=300μL÷60μL=5；1000：转化因子，即 1mmol/L=1000μ mol/L ；W：样品质量：mg

注意事项：

1. 吸光度变化应该控制在0.01～0.8之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参

与计算的稀释倍数要相应改变；也可以延长或者缩短反应时间。

2. 试剂盒2-8℃保存，保质期3个月，建议尽快使用。