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几丁质酶测试盒 试剂盒

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上海优选生物科技有限公司
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几丁质酶(Chitinase)试剂盒说明书

微量法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)

以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解,具有抵御真菌侵染的

作用,成为抗真菌病害的研究热点。

测定原理:

几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖,进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物,在585nm处有特征吸收峰,吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

自备实验用品及仪器

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、甲苯(土壤样品专用)和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 105mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,

加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2. 真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g4℃,离心20min,取上清置于冰上待测。

3. 培养液:直接测定。

测定操作表:

1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至585nm,对照管调零。

2、操作表


对照管  

测定管

粗酶液(μL)  

80  

80

提取液(μL)  

120  

40

试剂一(μL)  


80

混匀,37℃水浴 1h5000rpm4℃,离心 10min,取上清。

试剂二(μL)  

40  

40

混匀,沸水浴 7min

试剂三(μL)  

40  

40

试剂四(μL)  

80

80

混匀,37℃,15min,于微量石英比色皿/96 孔板,对照管调零,测定 A 585

计算公式:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y=2.3575x-0.0143R2=0.9989

计算公式:

1、 按照样本重量计算

酶活性定义:37℃条件下,每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性(mg/h/g= (A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)

=1.91×(A 585 +0.0143)÷W

V 反总:反应体系总体积,0.36mLV 样:反应体系中样本体积,0.08mLV 样总:加入提取液体积,1mLW:样本质量,g

2、 按照蛋白浓度计算

酶活定义:37℃条件下,每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

几丁质酶活性(mg/h/mg prot=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样×Cpr)

=1.91×(A 585 +0.0143)÷ Cpr

V 反总:反应体系总体积,0.36mLV 样:反应体系中样本体积,0.08mLCpr:蛋白浓度,mg/mL

3、按照细胞数量计算

酶活定义:37℃条件下,每104个细胞每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

细胞几丁质酶活性(mg/h/104cell=(A585+0.0143)÷2.3575×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)=1.91×(A 585 +0.0143)÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活定义:37℃条件下,每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶

量为一个酶活单位。

几丁质酶活性(mg/h/mL=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷V =1.91×(A 585 +0.0143

b.96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y=1.1788x-0.0143R2=0.9989

计算公式:

1、按照样本重量计算

酶活性定义:37℃条件下,每克组织每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量

为一个酶活性单位。

几丁质酶活性(mg/h/g=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)

=3.82×(A 585 +0.0143)÷W

V 反总:反应体系总体积,0.36mLV 样:反应体系中样本体积,0.08mLV 样总:加入提取液体积,1mLW:样本质量,g

2、按照蛋白浓度计算

酶活定义:37℃条件下,每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量

为一个酶活单位。

几丁质酶活性(mg/h/mg prot=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样×Cpr)

= 3.82×(A 585 +0.0143)÷ Cpr

V 反总:反应体系总体积,0.36mLV 样:反应体系中样本体积,0.08mLCpr:蛋白浓度,

mg/mL

3、按照细胞数量计算

酶活定义:37℃条件下,每104个细胞每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

几丁质酶活性(mg/h/104cell=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=3.82×(A 585 +0.0143)÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活定义:37℃条件下,每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶

量为一个酶活单位。

几丁质酶活性(mg/h/mL=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷V = 3.82×(A 585 +0.0143

注意事项:

1、 反应结束后立即进行比色。

2OD 值大于 0.8,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数;或者缩短 37℃水浴时间到 x 小时(如 0.5 小时),按照原先计算公式得到的结果再除以 x

3、 试剂四有一定的毒性,请操作时做好防护措施。

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