几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，

以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的

作用，成为抗真菌病害的研究热点。

测定原理：

几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

自备实验用品及仪器

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、甲苯（土壤样品专用）和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 105mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，

加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2. 真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液：直接测定。

测定操作表：

1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至585nm，对照管调零。

2、操作表

	对照管	测定管
粗酶液（μL）	80	80
提取液（μL）	120	40
试剂一（μL）		80
混匀，37℃水浴 1h，5000rpm，4℃，离心 10min，取上清。
试剂二（μL）	40	40
混匀，沸水浴 7min
试剂三（μL）	40	40
试剂四（μL）	80	80
混匀，37℃，15min，于微量石英比色皿/96 孔板，对照管调零，测定 A 585 。

计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=2.3575x-0.0143，R²=0.9989

计算公式：

1、 按照样本重量计算

酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（mg/h/g）= (A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)

=1.91×（A 585 +0.0143）÷W

V 反总：反应体系总体积，0.36mL；V 样：反应体系中样本体积，0.08mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g

2、 按照蛋白浓度计算

酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

几丁质酶活性（mg/h/mg prot）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样×Cpr)

=1.91×（A 585 +0.0143）÷ Cpr

V 反总：反应体系总体积，0.36mL；V 样：反应体系中样本体积，0.08mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；

3、按照细胞数量计算

酶活定义：37℃条件下，每10⁴个细胞每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

细胞几丁质酶活性（mg/h/10⁴cell）=(A₅₈₅+0.0143)÷2.3575×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)=1.91×（A 585 +0.0143）÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶

量为一个酶活单位。

几丁质酶活性（mg/h/mL）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷V 样=1.91×（A 585 +0.0143

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=1.1788x-0.0143，R²=0.9989

计算公式：

1、按照样本重量计算

酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量

为一个酶活性单位。

几丁质酶活性（mg/h/g）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)

=3.82×（A 585 +0.0143）÷W

V 反总：反应体系总体积，0.36mL；V 样：反应体系中样本体积，0.08mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g

2、按照蛋白浓度计算

酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量

为一个酶活单位。

几丁质酶活性（mg/h/mg prot）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样×Cpr)

= 3.82×（A 585 +0.0143）÷ Cpr

V 反总：反应体系总体积，0.36mL；V 样：反应体系中样本体积，0.08mL；Cpr：蛋白浓度，

mg/mL；

3、按照细胞数量计算

酶活定义：37℃条件下，每10⁴个细胞每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

几丁质酶活性（mg/h/10⁴cell）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=3.82×（A 585 +0.0143）÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶

量为一个酶活单位。

几丁质酶活性（mg/h/mL）=(A₅₈₅+0.0143) ÷2.3575×V 反总÷V 样= 3.82×（A 585 +0.0143）

注意事项：

1、 反应结束后立即进行比色。

2、 OD 值大于 0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短 37℃水浴时间到 x 小时（如 0.5 小时），按照原先计算公式得到的结果再除以 x。

3、 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。