β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase, β-GAL)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中, 能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解,此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量,还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解,释放自由的半乳糖。
测定原理:
β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100ml×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入2.5mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二:液体 4mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 13mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g 组织,
加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在 EP 管或96孔板中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
25 |
|
蒸馏水 |
25 |
|
试剂二 |
35 |
35 |
样本 |
10 |
10 |
迅速混匀,放入 37℃保温 30min |
||
试剂三 |
130 |
130 |
充分混匀, 400nm处测定吸光值 A,计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。
β -GAL 活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
β-GAL 活性(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=43.8×(ΔA+0.0027)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
β-GAL 活性(nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=43.8×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
β-GAL 活性(nmol/h/104cell) =[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.0876×(ΔA +0.0027)
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.07mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,0.5h。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.16x-0.0027;x为标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
β-GAL 活性(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=87.6×(ΔA+0.0027)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
β-GAL 活性(nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=87.6×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
β-GAL活性(nmol/h/104cell) =[(ΔA+0.0027)÷0.16×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.1752×(ΔA +0.0027)
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.07mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,0.5h。