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β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
β-GC（EC 3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；
β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放 HCN，从而防止昆虫取食。
测定原理：
β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。
自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入12mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、加样表
试剂名称（μL） |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
120 |
|
试剂二 |
150 |
150 |
样本 |
30 |
30 |
充分混匀，放入 37℃准确水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变） |
||
试剂一 |
120 |
|
充分混匀，8000g，4℃，离心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂） |
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上清液 |
70 |
70 |
试剂三 |
130 |
130 |
充分混匀，室温静置2min后，400nm 处测定吸光值A，计算 ΔA=A测定管-A对照管。
每个测定管需设一个对照管。
β-GC 活力计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/g 鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.125×(ΔA +0.0027)
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，0.5h。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y=0.16x-0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=125×(ΔA+0.0027)÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/g 鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=125×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.25×(ΔA +0.0027)
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，0.5h。
