山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）试剂盒说明书

紫外分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

SDH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。

测定原理：

SDH催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原NAD⁺生成NADH，测定340nm吸光度增加速率可以计算SDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入15mL蒸馏水，用不完的试剂仍4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入15mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，

加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

试剂名称(μL)	测定管
试剂一	400
试剂二	300
试剂三	300
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 5min
样本	50

将上述试剂按顺序加1 mL玻璃比色皿中，加样本的同时开始计时，记录 20 秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算 ΔA=A2-A1。

 

SDH 活性计算：

1、血清（浆）SDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=1688×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 SDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1688×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

=1688×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=3.376×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.05×10 ^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。