结合态淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS)
试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
GBSS(EC 2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中,催化淀粉链的加长反应,主要负责直链淀粉的合成。
测定原理
GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生成ADP;进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+ 还原为NADPH,其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比,通过340nm下测定NADPH 的增加量,可以计算GBSS活性。
需自备的的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液:液体 100mL×2 瓶,4℃保存;
试剂一:40mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入14mL试剂一充分混匀备用;用不完的试剂4℃
保存一周;
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入8mL试剂一充分混匀备用;用不完的试剂4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入10mL试剂一充分混匀备用;用不完的试剂 4℃
保存一周;
试剂五:液体×1 支,-20℃保存;临用前加入500μL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入500μL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存一周;
粗酶液制备
称取0.1~0.2g组织(建议称取约0.1g组织),加入1mL提取液,冰浴中匀浆。10000g ,4℃离心10min,弃上清,在沉淀中加入1mL提取液充分混匀,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、在EP管中按顺序加入下列试剂
试剂名称(μL) |
测定管 |
样本 |
75 |
试剂二 |
135 |
混匀,30℃保温 20 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却
试剂三 |
75 |
混匀,30℃保温 30 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却,10000g 25℃
离心 10min,取上清液(如果一次性测定样本较多,可以将试剂四、五和六按比例配成混合液)
上清液 |
150 |
试剂四 |
100 |
试剂五 |
5 |
试剂六 |
5 |
混匀后立即 340 nm波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。
注意:试剂二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混匀。
GBSS 活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T×稀释倍数=528×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×稀释倍数=528×ΔA÷W
V 反总:反应体系总体积,2.85×10 -4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.075 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;稀释倍数:1.73;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T×稀释倍数
=1056×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×稀释倍数 =1056×ΔA÷W
V 反总:反应体系总体积,2.85×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;
d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.075 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;
T:反应时间,2 min;稀释倍数:1.73;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。