结合态淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）

试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。

测定原理

GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP⁺ 还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH 的增加量，可以计算GBSS活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：液体 100mL×2 瓶，4℃保存；

试剂一：40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入14mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂4℃

保存一周；

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入8mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入10mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂 4℃

保存一周；

试剂五：液体×1 支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存一周；

粗酶液制备

称取0.1~0.2g组织（建议称取约0.1g组织），加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、在EP管中按顺序加入下列试剂

试剂名称（μL）	测定管
样本	75
试剂二	135

 

混匀，30℃保温 20 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却

试剂三

75

混匀，30℃保温 30 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，10000g 25℃

离心 10min，取上清液（如果一次性测定样本较多，可以将试剂四、五和六按比例配成混合液）

上清液	150
试剂四	100
试剂五	5
试剂六	5

混匀后立即 340 nm波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

GBSS 活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T×稀释倍数=528×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GBSS 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T×稀释倍数=528×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.85×10 ^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.73；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T×稀释倍数

=1056×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GBSS 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T×稀释倍数 =1056×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.85×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；

d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；

T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.73；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。